PTD-ΔNFATminiDBD融合蛋白的制备和生物学功能初步研究.docxVIP

PTD-ΔNFATminiDBD融合蛋白的制备和生物学功能初步研究

一、研究背景与目的

NFAT（活化T细胞核因子）作为一种重要的转录因子，在免疫反应、细胞增殖与分化等生物学过程中发挥关键调控作用。其功能异常与多种疾病的发生发展密切相关，因此针对NFAT的调控研究具有重要的医学价值。PTD（蛋白转导结构域）可介导外源蛋白高效进入细胞内，ΔNFATminiDBD（NFAT核心DNA结合结构域缺失突变体）有望通过竞争性结合DNA，抑制野生型NFAT的转录活性。

本研究旨在构建PTD-ΔNFATminiDBD融合蛋白的原核表达体系，实现融合蛋白的高效制备与纯化，并初步探究其对NFAT靶基因表达及相关细胞功能的影响，为后续开发NFAT调控相关疾病的干预策略提供实验基础。

二、PTD-ΔNFATminiDBD融合蛋白的制备

（一）重组表达载体的构建

目的基因扩增：根据GenBank中NFAT的基因序列，设计特异性引物（上游引物引入PTD序列及酶切位点，下游引物引入ΔNFATminiDBD序列及终止密码子），以人外周血单个核细胞cDNA为模板，通过PCR扩增获得PTD-ΔNFATminiDBD融合基因。

载体酶切与连接：将PCR产物与原核表达载体pET-28a（+）分别用NcoⅠ和XhoⅠ进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，用T4DNA连接酶在16℃条件下连接过夜，构建重组表达载体pET-28a-PTD-ΔNFATminiDBD。

重组载体鉴定：将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落培养后提取质粒，通过双酶切验证和基因测序确认重组载体构建正确。

（二）融合蛋白的诱导表达

转化与菌种活化：将鉴定正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，涂布于含卡那霉素（50μg/mL）的LB固体培养基，37℃培养过夜。

诱导表达条件优化：挑取阳性单菌落接种至LB液体培养基（含卡那霉素），37℃、220rpm振荡培养至OD???=0.6-0.8时，加入IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）进行诱导，设置IPTG浓度（0.2-1.0mmol/L）、诱导温度（25℃、30℃、37℃）和诱导时间（4-12h）梯度，通过SDS电泳分析融合蛋白的表达量，确定最佳诱导条件。

（三）融合蛋白的纯化

菌体裂解：将最佳条件下诱导表达的菌液离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬后，加入蛋白酶抑制剂，通过超声破碎仪裂解菌体（功率300W，工作3s，间隔5s，总时间20min），4℃、12000rpm离心30min，分别收集上清液和沉淀，SDS检测融合蛋白的可溶性。

亲和层析纯化：若融合蛋白主要存在于上清液中，采用Ni2?-NTA亲和层析柱进行纯化。先用平衡缓冲液（含20mmol/L咪唑的PBS）平衡层析柱，上样后用洗涤缓冲液（含50mmol/L咪唑的PBS）洗脱杂蛋白，再用洗脱缓冲液（含250mmol/L咪唑的PBS）洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，SDS检测纯化效果。

脱盐与浓缩：将纯化后的融合蛋白用截留分子量为10kDa的超滤离心管进行脱盐（PBS缓冲液置换）和浓缩，BCA法测定蛋白浓度，-80℃保存备用。

三、PTD-ΔNFATminiDBD融合蛋白的生物学功能初步研究

（一）融合蛋白的细胞转导效率检测

细胞培养：将JurkatT细胞（人急性T淋巴细胞白血病细胞）接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，37℃、5%CO?培养箱中培养至对数生长期。

荧光标记与转导：用FITC（异硫氰酸荧光素）标记纯化的融合蛋白，将不同浓度（5-20μg/mL）的荧光标记融合蛋白与JurkatT细胞共孵育2h，PBS洗涤3次后，通过流式细胞术检测细胞内荧光强度，计算转导阳性细胞率，评估融合蛋白的细胞转导效率。

（二）融合蛋白对NFAT靶基因表达的影响

细胞处理：将JurkatT细胞分为对照组（未处理）、PMA+离子霉素组（阳性对照，激活NFAT通路）、PMA+离子霉素+融合蛋白组（实验组，设置不同融合蛋白浓度），培养6h后收集细胞。

qPCR检测：提取各组细胞总RNA，逆转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测NFAT靶基因（如IL-2、TNF-α）的mRNA相对表达量，分析融合蛋白对NFAT转录活性的抑制作用。

（三）融合蛋白对细胞增殖的影响

采用CCK-8法检测融合蛋白对JurkatT细胞增殖的影响。将细胞接种于96孔板，加入不同浓度的融合蛋