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苹果MdFT基因的克隆与功能解析：开启果树花期调控新视野

一、引言

1.1研究背景与意义

果树花芽形成是产量形成的基础，对果树发育阶段转变和田间产量都极为重要。多数果树属于多年生木本植物，在首次开花结果前，通常需经历一个漫长的营养生长期，即童期。在童期内，任何方法都难以诱导其开花结果，这不仅严重阻碍了杂交育种的进程，延长了育种周期，还使得许多关于性状特征的评估任务无法在此期间开展。例如，苹果实生苗通常需要生长数年，达到一定的高度和节位才具备开花能力，研究表明实生苗需达到120节位以后才可能开花。传统方法在缩短童期方面存在诸多限制，而基因工程技术的发展为解决这一难题提供了新途径。

近年来的研究发现，FT蛋白被证明是植物中的“成花素”。苹果MdFT基因作为拟南芥AtFT基因的同源基因，在调控植物开花时间和花发育过程中可能发挥着关键作用。克隆和鉴定苹果MdFT基因，对于深入了解苹果的成花机制、缩短童期、加速苹果育种进程具有重要意义。同时，这也有助于为果树遗传改良和分子育种提供理论依据和技术支持，推动整个果树产业的发展。

1.2国内外研究现状

在植物成花机制的研究中，模式植物拟南芥的相关研究较为深入。AtFT基因被证实是植物开花调控途径中的关键基因，其编码的FT蛋白作为“成花素”，在叶片中合成后通过韧皮部运输到顶端分生组织，与FD蛋白相互作用，激活下游成花相关基因如AP1、SOC1、SEP3等的转录，从而促使顶端生长点转变为花的组织结构。

在苹果研究方面，国内外学者已对MdFT基因开展了一些研究。国内有研究通过RT-PCR扩增，从苹果栽培品种‘嘎拉’叶片cDNA中成功克隆了MdFT基因，并与从拟南芥生态型Columbia中克隆的AtFT基因进行对比分析，发现MdFT与AtFT在氨基酸水平上的同源性为72.6%。聚类分析表明，推导的MdFT蛋白与来自拟南芥、水稻、柑桔、杨树等的FT同源基因推导的蛋白同归于FT类。此外，通过构建植物表达载体35S::MdFT和35S::AtFT，并利用根癌农杆菌介导法导入拟南芥生态型Columbia和番茄栽培品种‘中蔬一号’中，得到了抗卡那霉素的阳性转化植株。经检测证明，这些基因已成功导入转化植株的基因组，并在转录水平得到表达。转基因拟南芥的QuantitativeRT-PCR检测表明，MdFT基因通过调节下游成花相关基因的表达诱导拟南芥产生早花现象。无论是转基因拟南芥植株还是番茄植株，均表现出早花性状。在短日照条件下，转35S::MdFT拟南芥植株在8-9片莲座叶期即开始抽薹开花，而野生型植株通常要在莲座叶长到60片以后才开始抽薹开花。在温室栽培条件下，35S::MdFT转基因番茄植株的花芽形成节位明显低于非转基因再生对照植株。

然而，目前对于MdFT基因在苹果自身生长发育过程中的调控机制，以及它与其他苹果成花相关基因之间的相互作用关系，仍缺乏深入系统的研究。此外，虽然已获得转基因植株并观察到早花现象，但MdFT基因在苹果实际生产应用中的潜力和效果，还需要进一步验证和评估。

1.3研究目标与内容

本研究旨在克隆苹果MdFT基因并对其功能进行初步鉴定，为深入探究苹果的成花机制提供理论基础。具体研究内容如下：

苹果MdFT基因的克隆：从苹果栽培品种的叶片中提取总RNA，经过纯化后，利用RNA逆转录酶进行cDNA合成。设计针对MdFT基因的特异性引物，利用PCR扩增目的基因序列。将PCR扩增的产物进行凝胶电泳和序列分析，确认MdFT基因的克隆成功。

MdFT基因的序列分析：对克隆得到的MdFT基因序列进行生物信息学分析，包括与其他物种FT同源基因的序列比对，分析其保守结构域和氨基酸序列特征；构建系统进化树，明确MdFT基因在FT基因家族中的进化地位。

植物表达载体的构建：将克隆得到的MdFT基因连接到合适的植物表达载体上，构建重组表达载体。通过酶切和测序验证载体构建的正确性，为后续的遗传转化实验做准备。

遗传转化与转基因植株的获得：利用根癌农杆菌介导法，将构建好的植物表达载体导入模式植物拟南芥和苹果愈伤组织中，获得转基因拟南芥植株和苹果转基因愈伤组织。通过抗性筛选和分子检测（如PCR扩增、实时荧光定量PCR等），鉴定转基因植株和愈伤组织。

MdFT基因的功能鉴定：对转基因拟南芥植株和苹果转基因愈伤组织进行表型观察，分析MdFT基因对植物开花时间、花器官发育等方面的影响。利用实时荧光定量PCR技术，检测转基因植株中与成花相关基因的表达水平，探究MdFT基因在成花调控途径中的作用机制。通过