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小麦Vp-1与W73基因启动子的克隆及功能特征解析

一、引言

1.1研究背景

小麦（TriticumaestivumL.）作为全球最重要的粮食作物之一，为人类提供了约20%的膳食能量和蛋白质，在保障全球粮食安全方面扮演着不可或缺的角色。在中国，小麦的种植历史源远流长，可追溯至新石器时代，是北方地区的主要粮食作物，其种植面积仅次于水稻。不同地区的小麦品种和种植方式因气候和土地条件的差异而有所不同，如冬小麦主要分布在黄淮海平原和长江中下游地区，春小麦则主要种植于东北和西北地区。

随着人口增长和环境变化，对小麦产量和品质的要求日益提高。传统育种手段已难以满足小麦品种改良的迫切需求，基因研究成为推动小麦遗传改良的关键。通过深入探究小麦基因的结构与功能，能够挖掘出具有重要价值的基因资源，为培育高产、优质、抗逆的小麦新品种提供坚实的理论基础和技术支撑。

1.2植物启动子研究综述

1.2.1基本结构

启动子是一段位于结构基因5’-端上游区的DNA序列，长度约100-1000个碱基。它能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合，并具有转录起始的特异性。启动子区域按功能可分成两大块，分别为“开关”——核心启动子元件和“调节器”——上游调控元件。

核心启动子元件包含转录起始点和TATA-BOX，主要作为RNA聚合酶结合并起始转录的位点。其中，转录起始点是mRNA合成的起始位置，TATA-BOX则能帮助RNA聚合酶准确识别转录起始位点。上游调控元件包含一系列的顺式作用元件，通过与反式作用因子结合改变转录效率。这些顺式作用元件能响应各种信号，如激素、环境胁迫等，从而调节基因的表达。在原核生物中，启动子通常由-10元件（Pribnowbox）与-35元件这两个核心元件组成。-10元件位于转录起始位点上游约10bp处，为RNA聚合酶全酶的识别和结合提供重要位点；-35元件位于-10元件上游约35bp处，与RNA聚合酶全酶的α亚基结合。真核生物启动子结构较为复杂，一般由核心启动子、近端启动子和远端启动子组成。核心启动子是引发转录的必要部分及转录起始点，包含RNA聚合酶结合位点、TATAbox和转录起始位点(TSS)。近端启动子是基因的近端上游序列，是特异转录因子结合位点集中区域，包括一些基本的调控元件，如TATA盒、CAAT盒、GC盒等。远端启动子是基因的远端上游序列，包括一些额外的调控元件，一般影响力较近端启动子弱。

1.2.2类型划分

根据启动子的表达特征，可将其分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。

组成型启动子一般来自于看家基因，能够使基因在所有组织中都能启动表达。其调控不受外界条件的影响，所启动基因的表达具有持续性，但不表现时空特异性。常见的组成型启动子有巨细胞病毒（CMV）启动子、β-肌动蛋白启动子（ACTB）、延伸因子-1α（EF1α）启动子、磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子、泛素C（UbC）启动子等。其中，CMV启动子是大家公认的启动真核基因表达的最有力量的启动子，在腺病毒和慢病毒过表达载体构建中应用最多。

诱导型启动子只有在一定的外界诱导或刺激作用下才能启动基因的表达。这些诱导或刺激因素包括温度、光照、激素、化学物质等。例如，热激启动子在高温条件下被激活，从而启动相关基因的表达，使植物能够适应高温胁迫。

组织特异性启动子只有在特定的器官或组织中才能启动基因的表达。它克服了组成型启动子启动的外源基因在受体中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加了转基因的效果。如在植物的根、茎、叶、花、果实等不同组织中，都有各自特异性的启动子。在种子特异性启动子的调控下，基因只在种子中表达，参与种子的发育和储存物质的合成。

1.2.3克隆技术手段

目前，常用的启动子克隆技术手段有PCR技术、环状PCR、启动子探针载体筛选等。

PCR技术是一种常用的克隆启动子的方法，其原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制过程。通过设计特异性引物，以基因组DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，经过变性、退火、延伸等步骤，实现对启动子序列的扩增。例如，反向PCR技术可用于克隆已知序列旁侧的启动子序列。其主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA，使酶切片段自身环化，然后以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知启动子序列。

环状PCR则是通过将线性DNA分子环化，然后以环化的DNA为模板进行PCR扩增，从而获得启动子序列。该方法可以避免传统PC