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平邑甜茶MhNCED和MhCCD基因的分离鉴定与功能解析：开启植物类胡萝卜素代谢研究新视野

一、引言

1.1研究背景

在植物的生长发育进程中，类胡萝卜素裂解加氧酶（Carotenoidcleavageoxygenases，CCOs）起着不可或缺的作用，其家族主要包含9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoiddioxygenases，NCEDs）和类胡萝卜素裂解双加氧酶（carotenoidcleavagedioxygenases，CCDs）这两个亚家族。NCEDs作为催化脱落酸（ABA）生物合成前体形成的关键限速酶，在植物应对干旱、高盐、低温等逆境胁迫时，能够通过调节ABA的合成，促使植物做出相应的生理响应，进而增强植物的抗逆能力。例如，在干旱胁迫下，植物体内的NCED基因表达量会显著上调，使得ABA合成增加，从而引发气孔关闭，减少水分散失，以此维持植物体内的水分平衡。

CCDs则能够催化类胡萝卜素在不同位置发生裂解，产生多种具有重要生理功能的脱辅基类胡萝卜素。这些脱辅基类胡萝卜素参与了植物生长发育的众多方面，包括激素合成、色素形成、香气物质产生等。像CCD1和CCD4参与了多种植物花、果实的着色及其香气物质如α-紫罗酮、β-紫罗酮的形成；CCD7和CCD8参与激素独脚金内酯的合成，而独脚金内酯在植物的分枝、根系发育以及与丛枝菌根真菌的共生等过程中发挥着关键的调控作用。由此可见，NCEDs和CCDs对植物的生长发育和环境适应具有关键作用。

平邑甜茶（Malushupehensis(Pamp)Rehd.）作为一种蔷薇科苹果属的野生海棠，是湖北海棠中的一个优良的大叶类型，也是典型的自发无融合生殖型多倍体种。其在苹果砧木育种和生产栽培领域具备极高的研究与利用价值，这主要归因于其诸多优良特性。平邑甜茶与苹果各品种在内部组织结构、生理和遗传上相近，亲和力高，嫁接成活率高，用其作砧木所嫁接的苹果品质好、寿命长，并有一定的矮化作用。此外，平邑甜茶还具有较强的抗逆性，对白粉病、白绢病、褐斑病及苹果绵蚜具有天然抗性，耐阴且抗涝性特强。然而，目前针对平邑甜茶中NCEDs和CCDs基因的研究还相对匮乏，对其基因序列、表达特性以及在生长发育和抗逆过程中的功能机制了解甚少。

1.2研究目的和意义

本研究旨在从平邑甜茶中分离出MhNCED和MhCCD基因，并对其功能进行初步鉴定。通过这一研究，一方面能够填补平邑甜茶在类胡萝卜素代谢途径关键基因研究领域的空白，为深入理解植物类胡萝卜素代谢途径的分子机制提供新的理论依据；另一方面，有助于揭示平邑甜茶响应环境胁迫的分子调控机制，为提高平邑甜茶的抗逆性提供基因资源和理论支持，从而推动平邑甜茶在苹果砧木生产中的广泛应用，提高苹果的产量和品质。

1.3国内外研究现状

国内外关于NCEDs和CCDs基因的研究已取得了一定的进展。在模式植物拟南芥中，对其CCDs家族9个基因的功能和调控机制已有较为深入的研究，明确了其中5个NCEDs亚家族成员参与ABA合成，4个CCDs亚家族成员参与多种类胡萝卜素的裂解过程。在其他植物中，如水稻、玉米、番茄等，也克隆和鉴定了多个NCEDs和CCDs基因，并对其在植物生长发育、抗逆性以及果实品质形成等方面的功能进行了研究。例如，在番茄中，通过对CCD1和CCD4基因的功能分析，发现它们在番茄果实的香气物质合成和果实成熟过程中发挥着重要作用。

然而，针对平邑甜茶的相关研究，目前主要集中在其生物学特性、资源分布以及作为苹果砧木的应用等方面，对于其基因层面，尤其是MhNCED和MhCCD基因的研究几乎处于空白状态。现有研究虽已认识到平邑甜茶的优良特性，但对这些特性背后的分子遗传机制缺乏深入探究，这在一定程度上限制了平邑甜茶的进一步开发和利用。因此，开展平邑甜茶MhNCED和MhCCD基因的分离及功能鉴定研究具有重要的理论和实践意义，有望为平邑甜茶的遗传改良和应用提供新的思路和方法。

二、材料与方法

2.1实验材料

实验所用的平邑甜茶种子采自山东农业大学泰安横岭果树实验站，挑选饱满、无病虫害的种子，经消毒处理后，播种于装有蛭石和营养土（体积比为1:1）的育苗盆中，置于光照培养箱内培养，培养条件为：光照强度2500lx，光照时间16h/d，温度25℃，相对湿度60%-70%。待幼苗长至4-6片真叶时，选取生长健壮、长势一致的幼苗用于后续实验。

实验所需的各种试剂，如RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA聚合酶、dNTPs、限制性内切酶、T4DNA连接