琼脂糖凝胶电泳中英文版.pdfVIP

琼脂糖凝胶电泳的操作步骤

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较

大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳

分离。

琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰

胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼

脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp

的DNA片段。

操作流程

准备干净的配胶板和电泳槽注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，

造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。

选择电泳方法

一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，

特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的

巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑

不出胶孔导致缺带。

正确选择凝胶浓度

对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片

段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用

质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带

不易分辨，造成条带缺失现象。

适合的电泳缓冲液

常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电

泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，

离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊

和不规则的DNA带迁移的现象。

电泳的合适电压和温度

电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的

DNA电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致

出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片

段跑出胶而出现缺带现象

DNA样品的纯度和状态

注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现

象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品

可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不

要对DNA样品加热，用20mMNaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。

DNA的上样

正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导

致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。

TIANGEN公司DNA分子量标准每次上样6ul即可得到清晰均匀的条带。

Marker的选择

DNA电泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正对照DNA来估计

DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近laer较密的，这样对

目标片段大小的估计才比较准确。TIANGEN公司的DNAMarker条带清晰，

亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。需要注意的是Marker的电泳同样也

要符合DNA电泳的操作标准。如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的

酶切Marker，需要预65℃加热5min，冰上冷却后使用。从而避免HindIII或

EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。

凝胶的染色和观察

实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是

稳定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBRGreen，GelRe，虽然毒性小，但

价格昂贵。TIANGEN公司的GeneGreen相比则是性价比高的低毒替代染料，

其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。注意观察凝胶时应根据染料不同使用

合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊

的现象。