摩氏摩根菌噬菌体MmP1内溶素基因预测、克隆、表达及生物学活性的初步研究.docxVIP

摩氏摩根菌噬菌体MmP1内溶素基因预测、克隆、表达及生物学活性的初步研究

一、研究背景与意义

摩氏摩根菌是一种常见的条件致病菌，可引发泌尿系统感染、伤口感染等多种疾病，近年来其耐药菌株的出现使得临床治疗面临严峻挑战。眼部作为人体敏感且脆弱的器官，也易受到摩氏摩根菌的侵袭，引发结膜炎、角膜炎等眼部感染病症，严重时可能导致视力下降甚至失明。目前，针对眼部摩氏摩根菌感染，传统抗生素治疗效果逐渐减弱，且可能带来眼部刺激等副作用，因此亟需寻找安全、高效的新型抗菌策略。

噬菌体内溶素是噬菌体在感染宿主菌后期产生的一类能够降解细菌细胞壁的酶类物质，具有特异性强、不易诱导细菌产生耐药性、对人体正常细胞毒性低等优势，在细菌性感染治疗领域展现出良好的应用前景。摩氏摩根菌噬菌体MmP1是一株对摩氏摩根菌具有较强裂解活性的噬菌体，其编码的内溶素可能成为治疗摩氏摩根菌感染（尤其是眼部感染）的潜在候选物质。

本研究旨在通过生物信息学方法预测摩氏摩根菌噬菌体MmP1内溶素基因的序列及功能特征，进而构建该基因的原核表达载体，实现其在大肠杆菌中的高效表达，并对表达产物的生物学活性进行初步检测，为后续开发基于该内溶素的眼部抗菌产品（如滴眼液、眼用凝胶等）奠定基础，同时也为噬菌体内溶素在临床感染治疗中的应用提供理论依据和实验支持。

二、材料与方法

（一）实验材料

菌株与噬菌体：摩氏摩根菌标准菌株（ATCC25830）、大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞、摩氏摩根菌噬菌体MmP1（实验室前期分离纯化并保存）。

载体与试剂：原核表达载体pET-28a(+)、限制性内切酶（BamHⅠ、XhoⅠ）、T4DNA连接酶、DNA聚合酶、DNAMarker、琼脂糖、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、His标签蛋白纯化试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、LB培养基、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、PBS缓冲液、革兰氏染色液等。

仪器设备：PCR仪、凝胶成像系统、高速离心机、恒温摇床、恒温培养箱、超净工作台、蛋白质电泳仪、蛋白质印迹转移仪、酶标仪、生物安全柜等。

（二）实验方法

1.摩氏摩根菌噬菌体MmP1内溶素基因的生物信息学预测

（1）噬菌体基因组提取：参照噬菌体基因组提取试剂盒说明书，提取摩氏摩根菌噬菌体MmP1的基因组DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop检测其纯度和浓度，确保满足后续测序及分析要求。

（2）基因组测序与序列分析：将提取的噬菌体基因组DNA送测序公司进行高通量测序，得到基因组原始序列数据。利用Trimmomatic软件对原始序列进行质量控制，去除低质量reads和接头序列；使用SPAdes软件对高质量序列进行拼接，获得噬菌体MmP1的基因组全序列。

（3）内溶素基因预测与定位：将拼接得到的噬菌体MmP1基因组序列提交至NCBI数据库，利用ORFFinder工具预测基因组中的开放阅读框（ORF）；通过BLASTp程序将预测的ORF氨基酸序列与NCBI非冗余蛋白质数据库（nr）进行同源性比对，筛选出与已知噬菌体内溶素蛋白具有较高同源性的ORF，初步确定内溶素基因的候选序列及位置。

（4）内溶素蛋白的功能特征分析：利用ExPASy-ProtParam工具分析候选内溶素蛋白的基本理化性质，包括分子量、等电点（pI）、氨基酸组成、亲水性/疏水性等；通过SignalP5.0服务器预测该蛋白是否存在信号肽序列；使用InterProScan工具分析其功能结构域，明确是否含有噬菌体内溶素典型的催化结构域（如糖苷水解酶结构域、酰胺酶结构域等）和结合结构域；借助SWISS-MODEL服务器构建内溶素蛋白的三维结构模型，预测其空间构象特征。

2.摩氏摩根菌噬菌体MmP1内溶素基因的克隆

（1）引物设计与合成：根据生物信息学预测得到的内溶素基因序列，结合原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点（BamHⅠ、XhoⅠ），利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。上游引物引入BamHⅠ酶切位点（5-CGGGATCCATGAAAAAATTTGTTGTTGCTG-3），下游引物引入XhoⅠ酶切位点（5-CCGCTCGAGTTATTTCTTCTTCTTGTGCGC-3），引物由测序公司合成。

（2）PCR扩增内溶素基因：以摩氏摩根菌噬菌体MmP1的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系（50μL）：10×PCRBuffer5μL、dNTPMixture（2.5mmol/Leach）4μL、上游引物（10μmol/L）2μL、下游引物（10μmo