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含量和有关物质方法学验证（HPLC法）

系统适用性试验的配制方法：

在100％浓度的主成分溶液中加入1%浓度的杂质对照品，以模拟样品中有可能存在的状态。

介绍配制方法——先配制杂质贮备液，再用供试品溶液（或浓的对照品溶液）来稀释，简便、易行！

检测波长的确定

涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分）

选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。

选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。

如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（f1.0），否则将得到错误的判断。

最小峰面积的设定

●其设定，不是绝对值，而是相对值。

●英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。普通样品

测定时，通常为1/10~1/20（即相当于样品测定浓度的0.1%~0.05%）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰面积为10000，那么，最

小峰面积可考虑设定为1000~500左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。

●原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。

检测限（将被测物溶液不断稀释后进样测定，直至被测物峰面积无法检出为止，此时的浓度即为最低检出浓度）：

●信噪比的三倍——纯属“纸上谈兵”，实际测定中根本用不上。

●是相对值，不是绝对值。是相对于供试品溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在5000倍以上。

有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系

浓度进样量绝对值相对于样品测定浓度的

最大进样量50mg/ml以上20ul

供试品溶液5mg/ml20ul100ug100%（5000倍）

对照溶液50ug/ml20ul1ug1%

最低检出量1ug/ml20ul20ng0.02%

根据最低检出浓度，采用“上推法”来确定供试品溶液浓度：如一般设定杂质总量小于1.0％对照液，对照溶液的浓度至少应为最低检出浓度的20～50倍，

供试品溶液浓度则应是最低检出浓度的2000～5000倍。同时还应考虑仪器、色谱柱等因素对最低检出浓度和最大进样浓度的影响(即耐用性因素)，所以

供试品溶液的浓度应在保证小于最大进样量的情况下，适当设定得高些，以保证该浓度在任何试验条件下，均有足够的检测灵敏度。表1为最低检出浓度、

最大进样量、供试品溶液和对照溶液间的比例关系(进样量10μl，规定杂质限度1.0％)。

表1最低检出量、最大进样量、供试品溶液和对照溶液间的比例关系

参数浓度/μg·ml–1绝对量/ng相当于供试品与最低检出

溶液浓度/％浓度的倍数

最大进样量3000

最低检出浓度0.110.02

供试品溶液浓度50050005000

对照溶液浓度5501.050

强力破坏试验条件有强光、高温、高湿、强酸、强碱、氧化破坏等。破坏时不能过于剧烈，一般以产生20％～30％杂质的条件为宜(《化学药物杂质研究

技术指导原则》，国家食品药品监督管理局药品审评中心)。同时，还可采用二极管阵列检测器(DAD)或质谱(MS)监测器进一步验证主峰纯度，观察主

峰中是否包含有被破坏产生的杂质峰。

方法学认证中溶液稳定性的全面判定

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