核酸的生物合成详解.pptVIP

核酸的生物合成详解演示文稿;（优选）核酸的生物合成;中心法则;第十四章核酸的生物合成;基本要求：

（1）掌握中心法则、DNA复制的基本过程及参与的酶和蛋白、逆转录、RNA的转录及其加工、DNA重组技术和PCR技术

（2）理解原核与真核生物DNA复制的差异、核酸合成的抑制剂

（3）了解RNA的复制、突变和修复的种类、基因工程的应用

教学重点及难点：

（1）DNA复制的基本过程及忠实性的保证、逆转录、RNA的转录及其加工

（2）DNA的重组技术;一、DNA的生物合成;1.DNA的复制;1.1DNA半保留复制;MeselsonStahl1958年利用同位素15N标记的大肠杆菌DNA首先证实。;1.2DNA半不连续复制;第十一页，共九十一页。;1.3大肠杆菌DNA复制的酶及相关因子;模板链

引物链（提供一个自由的3’-OH）

碱基互补;大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ;DNApolⅠ不是大肠杆菌中DNA复制的主要酶。

体内DNA合成速率比纯化的DNApolⅠ催化dNTP掺入速率(667nt/min)高20倍；

b.大肠杆菌的一个突变株中，DNApolⅠ活力正常，但染色体DNA复制不正常；

c.在一些突变株中,DNApolⅠ活力只是野生型的1%，但DNA复制正常,而此突变株对辐射和化学诱变剂却高度敏感。

DNApolⅠ在DNA损伤修复和切除RNA引物中发挥作用。;1970年发现DNApolⅡ。MW：120KD，DNApolⅡ具5’→3’聚合活性，仅为DNApolⅠ的5%。

DNApolⅡ具3’→5’外切酶活性，但无5’→3’外切酶活性。

DNApolⅡ缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制正常。

表明DNApolⅡ不是DNA复制的主要酶，它可能在DNA损伤修复中起一定作用。;DNApolⅢ至少以10种亚基组成的复合物形态存在。全酶形成一个非对称的二聚体，含两个核心酶，这种结构可使两条新合成的DNA链一同被复制。

催化dNTP掺入DNA链速率是DNApolⅠ的15倍。

其中?,?,θ三个亚基构成核心聚合酶(corepolymerase)。

DNApolⅢ具有5’→3’聚合酶活性、3’→5’核酸外切酶活性(?亚基)，但无5’→3’外切酶活性。

DNApolⅢ才是大肠杆菌DNA复制的关键酶。;大肠杆菌三种DNA聚合酶的比较;引物酶（又称DnaG蛋白）作用：以单链DNA为模板，利用核糖核苷酸合成RNA作为DNA合成的引物。

大肠杆菌引物酶：由大肠杆菌的dnaG基因编码的1条多肽链，MW：60KD，50-100分子/细胞。

引物酶与DnaB、DnaC、DnaT、PriA、PriB、PriC等蛋白组成引发体才有活性，这种复合体称为引发体。;DNA连接酶催化双链DNA中一条链上的断点的共价连接（磷酸二酯键的形成）。

借助ATP（真核细胞）或NAD+（大肠杆菌）水解提供能量。

两条链必须与同一条互补链配对结合，而且断点上的3’-OH和5’-磷酰基必须相邻。

DNA连接酶催化反应可逆。逆反应使共价闭环超螺旋DNA产生有缺口DNA-腺苷酸，生成松弛闭环DNA。

连接酶在DNA复制、修复、重组中起重要作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。;(4）DNA解旋酶（Helicase）;（5）单链结合蛋白SSB;（6）拓扑异构酶（DNATopoisomerase）;DNA双链

;;;;;;1.4原核生物的DNA复制;第三十一页，共九十一页。;1.4.1复制的起始;第三十三页，共九十一页。;大肠杆菌复制的起点由245个bp构成，其序列很保守，有两组短的重复：

3个13bp的序列和4个9bp的序列;20个DnaA结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物。

三组13bp重复区依次变性，产生开放型复合物。

解螺旋酶（DnaB）在DnaC协助下与开放复合物结合，进一步解链。

解链时带来的扭曲张力还需DNA旋转酶（属DNA拓扑异构酶Ⅱ）引入负超螺旋消除。;单链结合蛋白(SSB）结合在单链区，阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。

引物合成酶（DanG）催化合成最初的RNA引物。

引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子构成的复合体（引发体），以DNA为模板合成RNA引物（6-10个碱基）。;复制叉;DNA链的延伸;复制体沿着复制叉方向前进，同时进行前导链和滞后链的合成。

一分子的DNApolIII.协同合成前导链和滞后链，因此滞后链必须绕成一个突环。

;E;;终止;原核细胞DNA的半不连续复制复制过程;DNA聚合酶的5’-3’聚合酶活性部位对底物有选择作用（区分NTP和dNTP）；

具有3?→5?外切酶活性的DNA聚合酶是保证DNA复制真实性的主要