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学习资料单
《动物疫病检验技术》
新城疫血凝试验与血凝抑制试验（二）
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新城疫血凝试验与血凝抑制试验（二）
上节课我们讲了新城疫的病原体、临床症状、病理变化和实验室应用血凝试验进行新城疫病毒的检测，同学们，现在想一下，如果我们只通过实验室检测发现病毒有血凝现象的发生，就一定能确诊这个病是新城疫吗？不能，是吧，因为除了新城疫外，其他病毒也具有血凝现象，如：禽流感、流行性乙型脑炎等病毒。所以血凝现象不具有特异性。但是当病毒与相应的抗病毒抗体结合后，能使红细胞的凝集现象受到抑制，称为病毒的血凝抑制现象，简称病毒的血凝抑制。这种抑制是特异性的。主要应用鸡群的免疫水平的监测。
试验原理：
有些病毒，如禽流感病毒、新城疫病毒等，能凝集某种动物的红细胞，故可以来推测材料中有无该病毒的存在。如有能凝集红细胞的病毒，其凝集性可为相应的抗体所抑制，这种抑制还有特异性，故病毒的血凝抑制试验，可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体，也可用已知血清来鉴定未知病毒。
试验器材：
普通托盘天平、普通离心机、微型振荡器（MH-2）、DRAGON微量移液器（0.005～0.05mL）、DRAGON微量移液器（0.1～1mL）、Thermo微量移液器（2～10mL）、板式微量移液器架、96孔V型血凝反应板、烧杯、禽用采血器、具盖塑料离心管、指型离心管、试管架、细记号笔、生理盐水、3.8%柠檬酸钠溶液、新城疫标准抗原、75%酒精棉球、干棉球、标签纸、非免疫公鸡、待检血清等。
试验内容：
1、配制四单位病毒
A、4单位病毒概念：
规定用于血凝抑制试验的病毒需含4个血凝单位，即将一个血凝单位的病毒稀释度增加4倍浓度，例如，一个血凝单位为1：26，4个血凝单位则为1：24。
2、血凝抑制试验（HI）
B、试验步骤：
a.根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配成4个血凝单位病毒溶液。
b.在96孔“V”形微量板上进行，自第1孔至第11孔各加25微升生理盐水，第12孔加50微升生理盐水，11和12孔分别为4单位病毒液对照和红细胞对照。
c.第1孔加新城疫阳性血清25微升，混合均匀，吸25微升至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃25微升，如此稀释后血清浓度为第1孔1：2，第2孔1：4，第3孔1：8……。
d.自第1孔至11孔各加25微升4单位病毒液，混合均匀，室温下30min或置37℃温箱作用5～10min。
e.自第1孔至12孔各加1％鸡红细胞25微升。
f.振荡1min，混合均匀。
g.置室温下40min，4℃不少于60min（或37℃温箱作用15～30min），待4单位病毒对照孔已凝集红细胞，PBS对照孔(即生理盐水对照孔，或叫红细胞对照孔)的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时判定结果。
孔号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
稀释度
1∶2
1∶22
1∶23
1∶24
1∶25
1∶26
1∶27
1∶28
1∶29
1∶210
病毒对照
细胞对照
生理盐水
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
50
待检血清
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
弃去\
弃去
4单位病毒
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
轻叩混匀，室温下20min或置37℃温箱作用5～10min；
红细胞（1%）
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
振荡混匀，室温下30～40min或37℃温箱作用15～30min
一
一
一
一
一
一
++
+++
++++
++++
++++
一
++++为完全凝集；+++和++为不完全凝集；一为不凝集；
C、血清的HI滴度:
在对照出现正确结果的情况下（即病毒对照孔完全凝集，红细胞对照孔不凝集），以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的HI滴度或血凝抑制价。（如图例HI试验）HI价为1:26，一般写作6lg2，证明该鸡血清中含有ND病毒抗体。
结果判定：在红细胞对照孔红细胞完全沉淀，即呈明显纽扣状沉到孔底，并且抗原对照孔红细胞完全凝集于孔壁时观察试验结果，只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差在1个稀释度范围内，并且作用阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果方判定有效。
得出这样的试验结果，
那临床上有什么样的意义呢？接下来我们看看如何结合临床进行结果的分析：
（1）一般认为鸡的免疫临界水平为1:8(成年)或1:16(雏鸡)，随地区不同而稍有差异。
(2)鸡血清HI抗体效价高于1:16时可适当推迟新城疫
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