Foxp3突变体相关融合蛋白的表达、纯化、鉴定及生物学功能初步研究.docxVIP

Foxp3突变体相关融合蛋白的表达、纯化、鉴定及生物学功能初步研究

一、融合蛋白表达体系构建

载体构建

设计含Foxp3突变位点（如R337X、A384T）的基因序列，融合GFP/His标签（便于后续“可视化”检测，呼应“睛”的创意）

采用限制性内切酶酶切pET-28a（原核）/pCDNA3.1（真核）载体，通过同源重组插入目标基因

表达系统筛选

原核表达：转化BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导表达，优化温度（16-37℃）、诱导时间（4-20h）

真核表达：转染HEK293T细胞，采用PEI转染法，48h后收集细胞上清

二、融合蛋白纯化工艺

亲和层析

His标签：使用Ni-NTA琼脂糖树脂，洗脱缓冲液含250mM咪唑

GST标签：使用GST琼脂糖树脂，谷胱甘肽洗脱（50mMTris-HCl，10mM谷胱甘肽）

精细纯化

凝胶过滤层析（Superdex200）去除聚合体

脱盐处理（PD-10柱），将缓冲液置换为PBS（pH7.4）

纯度检测

Bradford法测定蛋白浓度

SDS电泳（12%分离胶），考马斯亮蓝染色验证纯度（目标纯度≥90%）

三、融合蛋白多维度鉴定

WesternBlot验证

一抗：抗Foxp3单克隆抗体（Abcam）、抗His/GST标签抗体

二抗：HRP标记羊抗鼠IgG，ECL化学发光显影

质谱鉴定

胶内酶解（胰蛋白酶）后，采用LC-MS/MS分析氨基酸序列，确认突变位点

结构分析

圆二色谱（CD）检测二级结构（α-螺旋、β-折叠比例）

动态光散射（DLS）测定蛋白hydrodynamicradius，验证均一性

四、生物学功能初步研究

Treg细胞分化调控实验

分离小鼠脾脏CD4+T细胞，加入不同浓度融合蛋白（0、10、50、100ng/mL）

流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例（抗CD4-PE、CD25-FITC、Foxp3-APC抗体）

细胞因子分泌检测

ELISA法测定细胞培养上清中IL-10、TGF-β（抑炎因子）及IFN-γ、IL-2（促炎因子）浓度

转录活性分析

双荧光素酶报告基因实验：构建Foxp3靶基因（如IL-2）启动子-luc载体，共转染HEK293T细胞与融合蛋白表达质粒，检测荧光素酶活性

五、“睛”创意应用设计

荧光追踪实验

利用GFP融合标签，激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在Treg细胞内的定位

活细胞成像技术（Incucyte）实时监测蛋白对细胞动态的影响

高通量筛选平台

构建基于荧光共振能量转移（FRET）的检测体系，筛选影响融合蛋白与DNA结合的小分子化合物