标准菌种确认标准操作规程.docVIP

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一目的

建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。

二范围

本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。

三内容

1.1试验菌株

大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC(B)26003]

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC(B)63501]

白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC(F)64941]

黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC(F)98003]

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC(B)10104]

生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC(F)98001]

1.1.1

1.1.1

1.1.1

1.1.1

1.1.2

1.1.2.1

1.1.2.2工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认

1.2菌种确认试验的主要内容

1.2.1

1.2.1

1.2.1

①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。

②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。

1.2.2

1.2.2

1.3菌种的确定方法

用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。

1.3.1

1.3.1

1.3.1.1.1取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～

1.3.1.1.2取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～

①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。

②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。

1.3.1

1.3.1

1.3.3.2革兰染色、镜检

1.3.3

1.3.3

1.3.4

1.3.4

1.3.4.1.1取白色念珠菌新鲜培养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基中，经35℃培养24～48h后，

1.3.4.1.2取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，经30～35℃培养24～48h（必要时延长至72小时）观察结果：

1.3.4.1.3取上述（5.3.4.1.2）培养物接种至白色念珠菌显色培养基平板上，经30～35℃培养24～48h（必要时延长至72小时）观察结果

1.3.4

取上述（5.3.4.1.3）培养物接种至1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上，培养24～48h。取培养物进行染色，镜检及芽管试验。

1.3.4

1.3.4.2.2芽管试验：挑取1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35～37℃

1.3.4.2.3镜检结果：革兰阳性芽孢杆菌芽孢为

1.3.5

1.3.5

1.3.6

1.3.6.1取铜绿假单胞菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃

1.3.6.1.1取上述培养物接种于溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基的平板上，培养18～

1.3.6.2

1.3.6

1.3.6

1.3.6

取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。

若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单孢菌。否则，应进行绿侬菌素试验。

1.3.6.4绿侬菌素(Pyocyanin)试验

取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养24小时，加三氯甲烷3~5ml至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入1mol/L盐酸试液约1ml，振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿侬菌素试验阳性，否