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PEI转染实验详细操作流程及注意事项

在分子生物学研究中，将外源核酸高效导入细胞是许多实验的基础。聚乙烯亚胺（Polyethylenimine,PEI）作为一种阳离子聚合物转染试剂，因其成本效益高、转染效率良好且适用范围广，在实验室中得到了广泛应用。然而，PEI转染的成功与否受多种因素影响，操作细节的把控至关重要。本文将结合实践经验，详细阐述PEI转染的操作流程及关键注意事项，希望能为实验者提供有益的参考。

一、实验原理简述

PEI转染的核心原理在于其结构中的大量氨基基团。在生理pH条件下，这些氨基质子化，使PEI携带正电荷，能够与带负电荷的核酸分子（如质粒DNA）通过静电相互作用结合，形成稳定的PEI-DNA复合物。该复合物凭借其正电性，可吸附于同样带负电荷的细胞膜表面，随后通过内吞作用进入细胞。进入细胞后，PEI的“质子海绵效应”在内涵体逃逸过程中发挥重要作用，帮助核酸释放到细胞质中，进而实现基因的表达或干扰。

二、实验材料准备

（一）细胞与培养相关

1.宿主细胞：选择状态良好、处于对数生长期的细胞。不同细胞系对PEI的敏感性和转染效率差异较大，需根据实验需求提前筛选和优化。

2.细胞培养基：通常使用含血清的完全培养基进行常规培养。转染时，建议准备无血清培养基（如Opti-MEM或相应基础培养基）用于稀释PEI和DNA。

3.胰蛋白酶：用于消化传代细胞。

（二）转染试剂与核酸

1.PEI试剂：常用的有线性PEI和分支状PEI，分子量也有多种选择（如25kDa线性PEI较为常用）。建议购买商品化的PEI转染试剂，或严格按照文献配方自行配制并验证。

2.质粒DNA：需保证较高的纯度（A260/A280比值约1.8-1.9）和超螺旋比例。提取过程中应避免酚、氯仿、乙醇、盐离子等杂质的残留，这些都会显著影响转染效率。

3.无菌去离子水或无核酸酶水：用于溶解PEI储存液和稀释DNA。

（三）耗材与仪器

1.细胞培养耗材：培养皿/板、离心管、移液管、Tips等，均需无菌。

2.移液设备：各种规格的微量移液器。

3.离心机：用于离心收集细胞或短暂离心混合液。

4.CO?培养箱：维持细胞生长的适宜环境。

5.生物安全柜：所有涉及细胞和核酸操作的步骤均应在此进行。

三、详细操作流程

（一）细胞接种

1.细胞复苏与传代：转染前一天，将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化，进行计数。

2.铺板：根据实验需求（如后续检测是mRNA水平还是蛋白水平，以及检测时间点），将细胞接种到相应规格的培养板中。关键是确保转染时细胞汇合度达到约70%-90%（不同细胞类型可能略有差异，需摸索）。使用含血清的完全培养基，置于CO?培养箱中常规培养过夜。

（二）PEI储存液的制备（若使用粉末自行配制）

1.称取一定量PEI粉末，加入无菌去离子水或无核酸酶水。

2.用浓盐酸（如1MHCl）调节pH至7.0左右（pH值对PEI转染效率影响较大，需精确测量）。

3.搅拌至完全溶解，定容至所需体积。

4.用0.22μm滤膜过滤除菌，分装后于-20℃冻存。使用前需完全解冻并混匀。商品化PEI试剂则按说明书稀释或直接使用。

（三）转染复合物的制备

1.DNA稀释：在无菌离心管（管A）中，加入适量无血清培养基（如Opti-MEM）。根据每个孔的DNA用量，加入相应量的质粒DNA，轻轻吹打混匀。稀释体积不宜过大，以保证DNA浓度适中，通常每孔DNA的稀释体积在几十到一百微升不等（如24孔板每孔可稀释至50μL）。

2.PEI稀释：在另一无菌离心管（管B）中，加入与管A等量的无血清培养基。根据预实验确定的DNA:PEI质量比（常用比例如1:2至1:5，需针对具体细胞系和PEI类型优化），计算所需PEI储存液的体积，加入管B中，轻轻吹打混匀。

3.复合物形成：将管A中的稀释DNA溶液逐滴加入到管B的稀释PEI溶液中，边加边轻轻混匀（或用移液器吹打几次）。

4.孵育：室温静置孵育15-25分钟，使PEI与DNA充分结合形成稳定的复合物。此时溶液可能会出现轻微浑浊，属正常现象。

（四）转染复合物的添加

1.观察细胞：转染前检查细胞状态，确保细胞贴壁良好、状态健康、无污染。

2.添加复合物：将孵育好的PEI-DNA复合物逐滴均匀加入到待转染的细胞培养孔中，边加边轻轻晃动培养板，使复合物均匀分布。

3.继续培养：将培养板放回CO?培养箱中，37℃继续培养。

（五）转染后换液（可选，根据细胞对PEI的耐受性调整）

1.对于对PEI毒性较敏感的细胞，可在转染后4-6小时，小心吸去含转染复合物的培养基，加入新鲜的完全培养基继续培养。

2.对于耐受性较好的细胞，也可以不换液，直接培养至检测时间点。