桂皮醛抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)生物膜形成的实验研究.docxVIP

桂皮醛抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)生物膜形成的实验研究

一、实验材料

菌株：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）标准菌株（ATCC43300），由[具体微生物实验室名称]提供。

试剂：桂皮醛（纯度≥98%，购自[试剂供应商名称]）；Mueller-Hinton（MH）肉汤、MH琼脂（购自[培养基供应商名称]）；结晶紫（分析纯，购自[化学试剂公司名称]）；二甲亚砜（DMSO，分析纯，购自[化学试剂公司名称]）；胰蛋白酶（购自[生物试剂公司名称]）。

仪器：超净工作台（[仪器型号及厂家]）；恒温培养箱（[仪器型号及厂家]）；酶标仪（[仪器型号及厂家]）；扫描电子显微镜（SEM，[仪器型号及厂家]）；实时荧光定量PCR仪（[仪器型号及厂家]）。

二、实验方法

（一）桂皮醛溶液的制备

精确称取一定量的桂皮醛，用DMSO将其溶解，配制成浓度为1000μg/mL的母液，然后用MH肉汤将母液稀释成不同浓度（12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL）的工作液，其中DMSO的终浓度不超过0.1%（经预实验验证，此浓度对MRSA生长及生物膜形成无影响）。

（二）MRSA菌液的制备

将MRSA标准菌株接种于MH琼脂平板上，37℃恒温培养24h，挑取单菌落接种于MH肉汤中，37℃、180r/min振荡培养12-16h，调整菌液浓度至1×10^6CFU/mL，备用。

（三）桂皮醛对MRSA生长的影响（MIC测定）

采用微量肉汤稀释法测定桂皮醛对MRSA的最小抑菌浓度（MIC）。在96孔板中，每孔加入100μLMH肉汤，然后在第1孔加入100μL桂皮醛工作液（200μg/mL），进行倍比稀释，得到不同浓度的桂皮醛溶液。最后每孔加入100μL调整好浓度的MRSA菌液，使菌液终浓度为5×10^5CFU/mL。同时设置阳性对照孔（只加菌液和MH肉汤）和阴性对照孔（只加MH肉汤）。37℃恒温培养24h后，用酶标仪测定各孔在600nm处的吸光度值（OD600），以无细菌生长的最低桂皮醛浓度为MIC。

（四）桂皮醛对MRSA生物膜形成的影响（结晶紫染色法）

在96孔板中，每孔加入100μL调整好浓度的MRSA菌液（1×10^6CFU/mL），然后分别加入100μL不同浓度（12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）的桂皮醛工作液，使桂皮醛终浓度分别为6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL。同时设置空白对照孔（只加MH肉汤）和生物膜对照孔（加菌液和MH肉汤，不加桂皮醛）。

37℃恒温培养24h后，小心吸弃各孔中的培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）轻轻洗涤3次，以去除浮游细菌。

每孔加入100μL0.1%结晶紫溶液，室温染色30min，然后用PBS洗涤3次，去除多余的结晶紫。

每孔加入100μL33%冰乙酸溶液，振荡10min，使结晶紫充分溶解。

用酶标仪测定各孔在570nm处的吸光度值（OD570），以OD570值表示生物膜的形成量。生物膜抑制率计算公式为：抑制率（%）=（1-实验组OD570值/生物膜对照孔OD570值）×100%。

（五）扫描电子显微镜（SEM）观察

将无菌盖玻片放入6孔板中，每孔加入2mL调整好浓度的MRSA菌液（1×10^6CFU/mL），然后分别加入2mL浓度为25μg/mL和50μg/mL的桂皮醛工作液（终浓度分别为12.5μg/mL和25μg/mL），同时设置生物膜对照孔（加菌液和MH肉汤，不加桂皮醛）。

37℃恒温培养24h后，取出盖玻片，用PBS轻轻洗涤3次，然后用2.5%戊二醛溶液4℃固定2h。

依次用30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液进行梯度脱水，每次15min。

用叔丁醇置换乙醇，然后冷冻干燥，喷金处理后，用扫描电子显微镜观察生物膜的形态结构，并拍照记录。

（六）实时荧光定量PCR检测生物膜相关基因表达

取不同浓度桂皮醛（12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL）处理后的MRSA菌液以及未处理的MRSA菌液（对照），37℃、180r/min振荡培养24h后，离心收集细菌（8000r/min，10min），用PBS洗涤2次。

按照细菌RNA提取试剂盒说明书提取细菌总RNA，并用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。

以cDNA为模板，采用实时荧光定量P