捻转血矛线虫Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制因子Hc-spi-i2基因的特性研究.pdfVIP

2.1Hc-spi-i2基因获得及重组质粒鉴定41

2.2pMD19-T-Hc-spi-i2质粒序列结果分析42

2.3Hc-spi-i2基因结构及氨基酸序列分析43

2.4Hc-SPI-I2中Kunitz功能域进化关系分析45

2.5Hc-spi-i2转录水平测定46

2.6原核表达Hc-SPI-I2蛋白47

2.7虫体定位48

2.8HEK293T细胞定位50

3.讨论50

4.小结52

第五章Hc-SPI-I2互作蛋白筛选及验证53

1.材料与方法54

1.1材料54

1.2实验方法55

2.实验结果57

2.1酵母质粒构建及酵母转化57

2.2酵母自激活验证58

2.3酵母双杂交筛选及验证59

2.4细胞内共定位观察61

2.5免疫共沉淀实验62

3.讨论63

4.小结64

第六章蛋白相互作用对NLRP3炎性小体的影响65

1.材料与方法66

1.1材料66

1.2实验方法66

2.实验结果70

2.1Caspase-1、NLRP3、ASC及IL-1β扩增及载体构建70

2.2同源性分析72

2.3NLRP3炎性小体体外构建72

2.4Hc-SPI-I2和GNB1对NLRP3的影响74

3.讨论75

4.小结76

全文小结77

参考文献78

附录I相关引物序列85

附录II溶液的配制88

致谢90

摘要

捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)是一种寄生在牛、羊、骆驼等反刍动物皱胃当中

的消化道线虫，感染后对宿主动物造成虚弱、贫血甚至死亡等危害，严重影响畜牧业发展，

对畜牧业具有重大经济意义。早期抗线虫药物开发使得捻转血矛线虫病得到一定控制，但

随着药物不合理使用，耐药性虫株逐渐增多导致防治效果下降。线虫入侵宿主过程是生活

史中的重要阶段，找寻在线虫入侵过程涉及的关键药物靶点，开发新型抗线虫药物，对于

防治工作尤为重要。Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制因子在蠕虫入侵宿主过程中能够抵御宿主

丝氨酸蛋白酶的降解作用，逃避宿主免疫反应，利于宿主体内寄生。因此，筛选出捻转血

矛线虫丝氨酸蛋白酶抑制因子相关基因，研究作用机制及相关功能，会对该病的防治提供

新思路。本研究从捻转血矛线虫蛋白组学数据库中筛选出入侵过程中表达水平升高的蛋白

酶抑制因子基因，从cDNA中进行扩增并命名为Hc-spi-i2，对基因结构、功能域及进化关系

进行了预测和分析；制备多克隆抗体，进行了Hc-SPI-I2蛋白的雌虫组织定位观察，转染

HEK293T细胞观察亚细胞定位；通过酵母双杂交系统在绵羊血cDNA文库中筛选出与Hc-

SPI-I2相互作用的绵羊GNB1蛋白，并通过免疫共沉淀及细胞共定位实验对互作关系进行

验证；探究了Hc-SPI-I2蛋白、绵羊GNB1蛋白及两者共同对NLRP3炎性小体的影响。

1.Hc-spi-i2基因特性分析及表达特性分析

通过WormBaseParasite网站获得筛选出的基因参考序列(GeneID：HCON，

通过分析可知其含有12个内含子，13个外显子。以H.contortusZJ株cDNA为模板，扩

增获得Hc-spi-i2的CDS序列，长度为3108bp，分析氨基酸序列可知存在1个信号肽和2

个Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制因子功能域，对该功能域所在碱基序列截短扩增，长度为

486bp，用于后续实验研究。检索寄生虫中Kunitz型功能域同源序列，通过MEGAX进

行保守性分析，并且绘制进化树，可知Kunitz型功能域较为保守。为研究Hc-SPI-I2表达

特性，利用qRT-PCR检测Hc-spi-i2在捻转血矛线虫各个时期转录水平，发现在L3期至

L4期转录水平显著升高，验证