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2025年微生物学实验设计与菌种鉴定专项测试卷

考试时间：______分钟总分：______分姓名：______

一、

请设计一个实验方案，用于从一桶混合了多种霉菌的土壤样品中分离纯化出产耐高温脂肪酶的菌株。要求详细说明实验步骤，包括样品处理、富集、分离、纯化、筛选以及初步的菌株保存方法。在方案中，请明确说明你将如何控制实验变量，以及选择哪些指标来初步判断分离到的菌株是否可能产生耐高温脂肪酶。

二、

简述革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的主要应用。假设你获得了一株未知细菌，通过革兰氏染色观察到其为革兰氏阴性菌。请列举至少三种不同的生化试验，并简要说明这些试验的原理，用以进一步区分该革兰氏阴性菌可能属于哪个主要的菌属（例如，肠杆菌科、假单胞菌属等）。

三、

比较并对比基于形态学特征和基于分子生物学方法（如16SrRNA基因序列分析）进行微生物鉴定的优缺点。在什么情况下，你更倾向于选择使用形态学方法？在什么情况下，分子生物学方法是更优的选择？请结合具体实例说明你的理由。

四、

某实验室需要鉴定一株从患者呼吸道分离出的革兰氏阳性球菌。实验室现有资源包括常规的生化反应管、革兰氏染色试剂、显微镜，以及可以申请使用API鉴定系统或联系测序中心进行16SrRNA基因测序。请分析上述可用的鉴定手段，并撰写一份简要的鉴定方案。在方案中，请说明你将如何利用现有资源进行初步鉴定，如果需要，你将如何决定是否以及如何使用API系统或进行测序，并解释你选择这些步骤的理由。

五、

设计一个简单的实验，用于评估两种不同培养条件下（例如，不同碳源或不同温度）对某株酵母菌产酒精能力的影响。请描述你的实验设计思路，包括如何设置实验组与对照组，选择哪些指标来衡量酵母菌的产酒精能力，以及需要控制哪些变量来确保实验结果的可靠性。

试卷答案

一、

实验方案：

1.样品处理：取适量土壤样品，使用无菌水进行系列稀释。取稀释液涂布于无菌平板。

2.富集（可选）：可在特定培养基（如含油脂）上培养，以选择性富集能利用脂肪的霉菌。

3.分离与纯化：采用稀释涂布法或划线分离法在合适的霉菌培养基（如察氏平板、马丁氏平板）上分离单菌落。反复划线分离，直至获得纯培养物。

4.筛选：

*将纯化菌株接种于含脂肪酶指示剂（如tributyrin培养基）的平板上，在适宜温度（如50-60°C）下培养。观察是否有透明圈产生，透明圈越大，可能产酶能力越强。

*或将菌株接种于液体发酵培养基中，在适宜温度下培养一定时间后，测定发酵液中的脂肪酶活性。

5.初步鉴定与保存：

*对产生明显透明圈的菌株进行初步形态学观察（显微镜下菌丝、孢子形态）。

*将有潜力的菌株接种于斜面培养基，进行低温（4°C）和冷冻（-20°C或-80°C）保藏。

变量控制：

*无菌操作：确保所有步骤无菌，防止杂菌污染。

*培养条件：温度、湿度、光照等保持一致。

*培养基成分：确保培养基成分准确无误。

*时间：控制各培养阶段的时间。

选择指标：脂肪酶指示剂平板上的透明圈大小、液体发酵培养基中测定的脂肪酶活性。

二、

革兰氏染色法原理：利用细菌细胞壁中脂质含量和结构的不同，通过与结晶紫-碘复合物结合后，再经酒精脱色，导致革兰氏阳性菌保留紫色，革兰氏阴性菌脱色后被复染剂（如沙弗宁）染成红色或粉色。

主要应用：初步将细菌分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-），这对后续选择生化试验、判断感染类型及选用抗生素具有重要指导意义。

进一步鉴定的生化试验：

1.氧化酶试验：原理是检测细胞膜上是否存在氧化酶。G+菌中的葡萄球菌属通常阳性，而多数G-菌（如肠杆菌科）阴性。假单胞菌属通常阳性。

2.吲哚试验（或称靛基质试验）：原理是检测细菌能否分解色氨酸产生吲哚。肠杆菌科细菌通常阳性，而假单胞菌属、不动杆菌属通常阴性。

3.乳糖发酵试验：原理是检测细菌能否在含乳糖的培养基中发酵产酸产气。肠杆菌科细菌通常阳性，而沙弗金氏菌属、不动杆菌属通常阴性。

三、

形态学鉴定优缺点：优点是相对快速、成本较低、设备要求不高；缺点是主观性强、分辨率有限、对于形态相似的细菌难以区分、不能深入到分子水平。

分子生物学鉴定优缺点：优点是准确性高、可区分形态相似细菌、可进行菌株间关系构建、可鉴定未知菌；缺点是成本较高、需要专门设备和试剂、实验周期相对较长、可能存在数据库匹配问题。

选择依据：

*形态学方法倾向：快速初步筛选，区分有明显形态差异的类群（如球菌vs杆菌），或当预算/资源有限，且对鉴定精度要求不是极高时。

*分子生物学方法倾向：需要精确鉴定未知菌种，特别是临床感染或重要环境样品中的菌种，