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基于hTERT基因转染技术构建永生化成釉细胞瘤细胞株的实验探究

一、引言

1.1研究背景与意义

成釉细胞瘤（ameloblastoma，AM）作为口腔颌面部最常见的良性牙源性肿瘤，虽属良性，却具有局部侵袭性生长的特性，术后复发率较高，可达50％-90％。少部分肿瘤还可表现出恶性组织学特征和（或）临床行为，被称为成釉细胞癌。目前，手术是治疗成釉细胞瘤的主要手段，但由于对其细胞增殖和侵袭机制的认识有限，难以从根本上解决复发等问题，给患者带来极大痛苦。

细胞株是研究肿瘤生物学行为的重要工具。然而，原代培养的成釉细胞瘤细胞存在存活时间短、增殖不活跃等问题，限制了对其深入研究。永生化细胞株能够克服这些缺点，为长期观察和深入研究成釉细胞瘤的生物学行为提供了良好条件。

人端粒酶逆转录酶（humantelomerasereversetranscriptase，hTERT）基因在细胞永生化过程中发挥着关键作用。端粒酶是一种细胞核糖核蛋白逆转录酶，能延长端粒长度，维持端粒的稳定和染色体的完整，而hTERT是端粒酶的催化亚基，是端粒酶活性的限速因子。在几乎90％的肿瘤中都有端粒酶的激活，通过转染hTERT基因有可能建立永生化的成釉细胞瘤细胞株，从而为成釉细胞瘤的发病机制、治疗靶点等研究提供有力工具，有助于推动口腔医学领域的发展，为临床治疗提供新的思路和方法。

1.2国内外研究现状

在成釉细胞瘤细胞株建立方面，国内外学者进行了诸多尝试。早期研究中，体外培养的成釉细胞瘤细胞呈多边形、铺路石样排列，保持二倍体细胞的特征，但细胞增殖不活跃，存活时间有限。如陶谦等应用基因转染方法将SV40Tag整合到体外培养的成釉细胞瘤细胞基因组中，成功建立了永生化的成釉细胞瘤细胞株TAM-1，传代25次后仍保持生长旺盛。然而，SV40Tag可能存在潜在的致癌风险，限制了其进一步应用。

对于hTERT基因功能的研究，国外起步较早。研究表明，hTERT基因启动子富含GC而几乎不含TATA盒或CAAT盒，其转录调节主要发生在转录起始位点上游181bp区域内。多种转录因子参与hTERT基因的转录调控，如c-Myc可通过与Max形成异源二聚物结合到hTERT基因启动子的E-box序列上，进而转激活hTERT基因表达。在国内，钟鸣等通过原位杂交法检测发现hTERTmRNA在成釉细胞瘤中高达94.0％（47／50），且c-fos与hTERTmRNA呈正相关，提示c-fos可能参与成釉细胞瘤中端粒酶活性的调节。

尽管已有一定成果，但目前仍存在不足。一方面，现有的永生化成釉细胞瘤细胞株存在局限性，需要寻找更安全有效的永生化方法；另一方面，对于hTERT基因转染后对成釉细胞瘤细胞生物学特性的全面影响，以及该细胞株在成釉细胞瘤治疗研究中的具体应用等方面，还缺乏深入系统的研究。本研究将创新性地利用hTERT基因转染成釉细胞瘤细胞，旨在建立更理想的永生化细胞株，并深入探究其生物学特性及应用潜力。

1.3研究目标与内容

本研究旨在通过转染hTERT基因，成功建立永生化的成釉细胞瘤细胞株，并对其生物学特性进行深入分析，评估该细胞株在成釉细胞瘤研究中的应用潜力。具体研究内容包括：

永生化成釉细胞瘤细胞株的构建：获取原代成釉细胞瘤细胞，采用合适的基因转染技术将hTERT基因导入细胞中，通过筛选和克隆培养，建立稳定表达hTERT基因的永生化成釉细胞瘤细胞株。

hTERT基因转染对成釉细胞瘤细胞生物学特性的影响：对比分析转染前后细胞的增殖能力、侵袭能力、凋亡情况、细胞周期分布等生物学特性的变化，探讨hTERT基因在成釉细胞瘤细胞永生化及生物学行为改变中的作用机制。

永生化成釉细胞瘤细胞株的应用潜力评估：将建立的细胞株应用于药物敏感性实验、分子机制研究等方面，评估其在成釉细胞瘤治疗靶点筛选、药物研发等领域的应用价值。

二、相关理论基础

2.1成釉细胞瘤概述

2.1.1成釉细胞瘤的定义与分类

成釉细胞瘤是一种常见的牙源性肿瘤，起源于牙釉质发育过程中残留的成釉细胞或其前体细胞。它在牙源性肿瘤中占据重要地位，约占牙源性肿瘤的10%-20%。其肿瘤细胞形态和排列方式与成釉器或牙板上皮相似，这也是其名称的由来。

根据世界卫生组织（WHO）的分类标准以及常见的组织学特征，成釉细胞瘤主要分为以下几种类型：

滤泡型：此型最为常见，肿瘤上皮形成孤立性上皮岛，上皮岛中心由多边形或多角形细胞组成，这些细胞类似于成釉器的星网状层；周边围绕一层立方状或柱状细胞，类似成釉细胞或前成釉细胞，细胞核呈栅栏状排列并远离基底膜。上皮岛之间为疏松结缔组织间质，这种结构使得肿瘤在