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过氧化氢酶活性测定实验指导

一、实验目的

1.理解过氧化氢酶的生物学功能及其在生物体内的重要性。

2.掌握通过紫外分光光度法测定过氧化氢酶活性的原理和具体操作步骤。

3.学会计算过氧化氢酶的比活力，并能对实验结果进行初步分析。

4.熟悉紫外分光光度计的使用方法及注意事项。

二、实验原理

过氧化氢酶（Catalase,CAT,EC1.11.1.6）是一种广泛存在于生物体内的抗氧化酶，能够催化过氧化氢（H?O?）分解为氧气（O?）和水（H?O），从而清除生物体内因代谢产生的过量H?O?，保护细胞免受氧化损伤。其催化反应如下：

2H?O?→2H?O+O?↑

本实验采用紫外分光光度法测定过氧化氢酶的活性。H?O?在紫外光区240nm处有特征吸收峰，而过氧化氢酶催化H?O?分解后，体系中H?O?浓度降低，导致240nm处的吸光度值随之下降。通过测定一定时间内反应体系在240nm处吸光度的变化速率，可以计算出过氧化氢酶分解H?O?的速率，进而表征其酶活性。

酶活性单位通常定义为：在一定条件下（如特定温度、pH值），单位时间内分解单位量的底物（或生成单位量的产物）所需的酶量。本实验中，过氧化氢酶活性可表示为每毫克蛋白每分钟分解H?O?的微摩尔数（μmolH?O?·mg?1protein·min?1），或每克鲜重组织每分钟分解H?O?的微摩尔数（μmolH?O?·g?1FW·min?1），具体根据实验材料和需求而定。

三、实验材料与试剂

（一）实验材料

新鲜植物叶片（如小麦、菠菜、土豆等，根据实验需求选择）、动物组织（如肝脏、肾脏等）或微生物细胞。本指导以植物叶片为例。

（二）实验试剂

1.磷酸缓冲液（PBS,0.1mol/L,pH7.0）：准确称取磷酸二氢钾（KH?PO?）和磷酸氢二钾（K?HPO?·3H?O），用蒸馏水溶解并定容，调节pH至7.0。此缓冲液用于提取酶和配制反应体系。

2.H?O?溶液（10mmol/L）：取适量30%H?O?（分析纯），用0.1mol/LpH7.0的磷酸缓冲液稀释至10mmol/L。H?O?溶液不稳定，需现用现配，并通过紫外分光光度法或滴定法进行精确标定其浓度。

*标定方法（紫外法参考）：H?O?在240nm处的摩尔消光系数ε为39.4L·mol?1·cm?1。将新配制的H?O?溶液用缓冲液适当稀释后，测定其在240nm处的吸光度（A）。根据公式：浓度c(mmol/L)=A/(ε×L)×1000，其中L为比色皿光程（cm）。若浓度不符，需进行调整。

3.酶提取液：即上述0.1mol/LpH7.0的磷酸缓冲液。如需抑制蛋白酶活性，可在提取液中加入少量聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或适量蛋白酶抑制剂（如PMSF）。

四、实验仪器与设备

1.紫外可见分光光度计

2.高速冷冻离心机

3.组织捣碎机或研钵（匀浆器）

4.恒温水浴锅

5.分析天平

6.移液器及配套吸头（1mL,200μL,20μL等）

7.容量瓶（50mL,100mL,1000mL）

8.烧杯、试管、离心管等玻璃或塑料器皿

9.移液管、洗耳球

10.冰箱

11.计时器

五、实验步骤

（一）酶粗提液的制备

1.取材与称量：选取新鲜、健康的植物叶片，用蒸馏水洗净，用吸水纸吸干表面水分。去除主脉，剪碎。准确称取一定量（如1-2g）鲜样，放入预冷的研钵中。

2.匀浆：向研钵中加入5-10mL预冷的0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲液（提取液），加入少量石英砂（或海砂），在冰浴条件下快速研磨成匀浆。研磨过程中注意保持低温，防止酶失活。

3.离心：将匀浆液全部转入离心管中，平衡后，于4℃条件下，以适当转速（如10,000×g）离心10-15分钟。

4.取上清：离心结束后，小心吸取上清液，即为过氧化氢酶粗提取液。若上清液浑浊，可再次离心或用滤纸过滤。将酶提取液置于冰浴中保存备用，避免反复冻融。

（二）蛋白质浓度测定（可选，若需计算比活力）

采用考马斯亮蓝G-250染色法或Lowry法等测定酶提取液中的蛋白质浓度。具体操作参照相应试剂盒说明或标准实验方法进行。

（三）过氧化氢酶活性测定（紫外分光光度法）

1.仪器准备：打开紫外可见分光光度计，预热30分钟。设置测定波长为240nm，调节仪器至工作状态。

2.反应体系配制：

*取石英比色皿2个，分别标记为“对照管”和“样品管”。

*向两管中均加入2.8mL0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲液和0.1mL10mmol/LH?O?溶液，混匀。

3.基线校正（空白测定）：将对照管和样品管（此时尚未加酶）