病毒感染实验操作指南word版.docxVIP

前言

本指南旨在为从事病毒学相关研究的实验人员提供一套相对规范、安全且具有可操作性的病毒感染实验操作流程。病毒感染实验涉及潜在的生物安全风险，同时实验结果的准确性高度依赖于标准化的操作。因此，在开始任何相关实验前，操作人员必须经过严格的生物安全培训，熟悉所操作病毒的生物安全等级及特性，并严格遵守实验室生物安全管理规定和本指南的操作步骤。本指南适用于常规细胞水平的病毒感染实验，具体细节可能需根据所用病毒种类、宿主细胞类型及实验目的进行适当调整。

一、实验前准备

1.1人员要求与培训

*操作人员必须具备相应的病毒学实验背景知识，并已通过实验室生物安全培训，特别是针对所操作病毒生物安全级别的专项培训。

*熟悉本指南及相关SOP（标准操作规程），并经考核合格后方可独立操作。

*实验操作需在指定的生物安全柜内进行，严禁在开放环境下操作具有生物安全风险的病毒。

1.2实验材料与试剂准备

1.2.1病毒株

*确认病毒株的名称、编号、来源、滴度、保存条件及生物安全等级。

*病毒的复苏、扩增及保存应严格按照其特性及相关规定进行，避免反复冻融。

1.2.2宿主细胞

*选择对目标病毒敏感的宿主细胞系，并确保细胞来源可靠、身份明确、无污染（如细菌、真菌、支原体及其他病毒）。

*熟悉所用细胞的生长特性、培养条件（如培养基种类、血清浓度、CO?浓度、培养温度等）。

1.2.3主要试剂

*细胞培养基（如DMEM、RPMI-1640等，根据细胞类型选择）

*胎牛血清（FBS）或其他适宜血清（需确认血清对病毒感染无抑制作用或已进行灭活处理）

*胰蛋白酶-EDTA消化液

*磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2-7.4）

*抗生素（如青霉素、链霉素，根据需要添加）

*病毒稀释液（通常为含低浓度血清或无血清的相应细胞培养基）

*（可选）病毒感染增强剂、中和抗体等

1.2.4实验耗材

*一次性无菌培养皿、培养瓶、多孔细胞培养板（如6孔、12孔、24孔、96孔板等，根据实验需求选择）

*一次性无菌离心管（1.5mL,15mL,50mL）

*一次性无菌移液管（各种规格）或电动移液枪配套无菌吸头

*一次性无菌过滤器（如0.22μm滤膜，用于过滤除菌上清）

*其他：无菌封口袋、记号笔、标签等

1.3仪器设备准备与检查

*生物安全柜：使用前检查其运行状态，包括气流、紫外灯、照明灯等，并进行常规清洁消毒（如75%乙醇擦拭工作台面及内壁）。

*CO?培养箱：检查CO?浓度、温度是否设定正确并稳定，定期清洁消毒，避免污染。

*倒置显微镜：确保镜头清洁，工作正常。

*离心机：根据需要选择合适的转头，使用前检查平衡及离心参数设置。

*超低温冰箱、冰箱：确认温度设置正确，用于存放病毒、试剂等。

*移液器：定期校准，确保精度。

*（可选）酶标仪、荧光显微镜、流式细胞仪等检测设备。

1.4个人防护装备（PPE）准备

实验人员进入实验室前，必须按规定穿戴好个人防护装备，至少包括：

*实验服（长袖、防水）

*一次性手套（建议双层佩戴，操作过程中若污染或破损应立即更换）

*防护眼镜或护目镜

*（根据生物安全等级要求）口罩、帽子、鞋套、防护服等

二、病毒准备

2.1病毒复苏（如为冷冻保存）

*从超低温冰箱中取出冻存的病毒液，迅速置于37℃水浴锅中快速解冻，期间轻轻晃动以加速融化。

*解冻后立即用75%乙醇擦拭病毒管外壁，然后移入生物安全柜内操作。

*根据病毒滴度和实验需求，可直接用于感染或进行进一步扩增。

2.2病毒扩增（如需要）

*按照细胞培养常规方法，准备处于对数生长期、状态良好的宿主细胞。

*当细胞生长至适当汇合度时，弃去旧培养基，加入适量的病毒稀释液（含适量初始病毒）。

*按照预定的感染条件（如MOI、孵育时间）进行病毒吸附。

*吸附结束后，弃去病毒液（或根据病毒特性决定是否保留），加入新鲜的维持培养基。

*将细胞置于适宜条件下培养，每日观察细胞病变效应（CPE）。

*待大部分细胞出现明显CPE时（通常为70%-90%），收获病毒上清。

*收获的病毒上清可通过低速离心（如3000rpm，10分钟）去除细胞碎片。

*（可选）如需更高纯度或浓缩病毒，可进行超速离心或其他方法纯化浓缩。

*测定病毒滴度后，分装保存于-80℃或液氮中，避免反复冻融。

2.3病毒滴度测定

病毒滴度是衡量病毒感染性的重要指标，常用方法包括空斑形成实验（PFU法）、TCID??法（50%组织培养感染剂量法）等。具体操作方法参照相应的标准操作规程进行。实