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胰岛素工艺流程

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目录

01

原料准备与处理

02

发酵培养阶段

03

蛋白分离纯化

04

化学修饰转化

05

制剂生产流程

06

质量检测控制

01

原料准备与处理

工程菌株复苏活化

菌落形态鉴定

采用平板划线法分离单菌落，通过显微镜观察菌体形态及革兰氏染色结果，结合PCR技术验证目标基因完整性，排除变异或污染风险。

活力检测与优化

通过比浊法测定菌液OD值，结合ATP生物发光法量化菌体代谢活性，必要时调整复苏条件（如添加微量元素或生长因子）以提升活化效率。

菌株解冻与复壮

将冷冻保存的工程菌株梯度解冻后接种于专用复苏培养基，通过控制温度、pH及溶氧量促进菌体活性恢复，确保后续扩培的稳定性。

03

02

01

将活化后的菌株接种至摇瓶培养体系，严格控制转速、温度及通气量，监测菌体生长曲线至对数中期，确保生物量达到转接标准。

种子液逐级扩培

一级种子培养

将一级种子液按比例转移至小型发酵罐，采用补料分批培养策略动态调节碳氮比，实时监测溶解氧与尾气CO2浓度以优化代谢流分布。

二级种子罐扩增

每级扩培后取样进行无菌试验（如硫乙醇酸盐培养基培养），并通过HPLC检测代谢副产物（如乙酸）积累量，确保种子液符合发酵接种要求。

无菌检测与质量控制

碳氮源精准配比

添加硫酸镁、氯化钙等无机盐维持渗透压，同时配置磷酸盐缓冲系统稳定pH，避免发酵过程中酸碱波动影响胰岛素前体表达效率。

微量元素与缓冲体系

消泡剂与氧载体优化

针对高密度发酵易发泡特性，复合使用聚醚类消泡剂；必要时引入全氟化碳等氧载体提升氧传递速率，保障菌体需氧代谢需求。

以葡萄糖和酵母提取物为基础碳氮源，根据菌株代谢特性添加特定氨基酸（如色氨酸、苯丙氨酸）及维生素B族，平衡菌体生长与产物合成需求。

发酵培养基配制

02

发酵培养阶段

大型生物反应器参数控制

反应器内部温度需严格控制在特定范围内，通过集成传感器和自动化系统实时调整加热或冷却模块，确保微生物代谢活性处于最佳状态。

温度精准调控

搅拌速率优化

压力与通气量管理

根据菌株特性和培养阶段动态调整搅拌桨转速，平衡溶氧效率与剪切力对菌体的损伤风险，避免泡沫过度生成。

通过背压阀和流量计维持反应器内稳定气压，配合无菌空气过滤系统，确保氧气传递速率满足高密度发酵需求。

溶氧与pH实时调节

溶氧反馈控制

采用极谱法或光学传感器连续监测溶解氧浓度，通过调节通气速率、搅拌功率或富氧气体补加，维持溶氧水平在临界值以上。

pH动态平衡

建立溶氧、pH与补料速率的关联算法，避免单一参数调整引发的系统震荡，提升发酵过程稳定性。

利用酸碱泵自动补加氨水或碳酸钠溶液，中和微生物代谢产生的有机酸，保持培养环境pH波动不超过设定阈值。

多参数联动策略

菌体生长密度监测

通过在线分光光度计实时测定发酵液OD600值，结合标准曲线换算菌体干重，判断对数生长期向稳定期过渡的临界点。

光学密度检测

定期取样进行台盼蓝染色或ATP含量检测，区分活菌与死菌比例，评估培养体系是否出现异常衰亡现象。

细胞活性分析

监测葡萄糖消耗速率与乳酸等代谢物积累量，间接推算菌体增殖效率，为补料分批培养提供数据支撑。

代谢副产物关联

03

蛋白分离纯化

细胞破碎与包涵体提取

包涵体洗涤与溶解

采用低浓度尿素或去垢剂（如TritonX-100）洗涤包涵体杂质，后续使用强变性剂（如8M尿素或6M盐酸胍）溶解目标蛋白。

超声破碎辅助溶解

通过高频超声波空化效应破碎细胞，适用于小规模实验，需优化超声功率和时间以平衡破碎效率与蛋白稳定性。

高压均质破碎技术

利用高压剪切力破坏细胞膜结构，释放胞内胰岛素前体蛋白，需控制压力与循环次数以避免过度破碎导致蛋白降解。

将变性蛋白溶液缓慢加入复性缓冲液中，逐步降低变性剂浓度，促使胰岛素分子正确折叠，需监测pH与温度以维持复性效率。

梯度稀释复性法

添加还原型谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）模拟细胞内环境，促进二硫键正确配对，避免错误折叠产物的形成。

氧化还原体系调控

利用His标签或GST标签与固相介质结合，通过逐步洗脱实现蛋白定向复性，减少聚集沉淀风险。

亲和标签辅助复性

变性复性操作流程

层析柱多级纯化

离子交换层析（IEC）

根据胰岛素等电点特性，选用阴离子或阳离子交换树脂，通过盐浓度梯度洗脱分离杂质与目标蛋白，优化缓冲液pH以提高分辨率。

疏水相互作用层析（HIC）

利用高盐条件下胰岛素疏水特性吸附于苯基琼脂糖介质，低盐洗脱实现高纯度分离，适用于去除宿主细胞蛋白残留。

凝胶过滤层析（SEC）

基于分子量差异分离胰岛素单体与聚合体，选用高分辨率介质（如Superdex75）并控制流速以减少扩散效应。

04

化学修饰转化

酶切重组人胰岛素

产物监测

通过HPLC或质谱分析酶切后产物的分子量及纯