2025年相差显微镜.docVIP

相差显微镜

一、试验目

掌握相差显微镜原理，构造及其使用措施。

二、器材与试剂

一般复式显微镜，相差显微镜附件：相差物镜、转盘聚光器、调中合轴望远镜和绿色滤色镜、载片、盖片、滤纸、活体生物样品等。

三、试验原理

在显微镜下镜检时，视场中样品只有在反射光波长（颜色）和振幅（亮度）与周围介质有变化时，方能窥见被检样品。活样品多为无色透明，照明光线通过这种物体时，透过或反射光波长和振幅都不发生变化，因此用一般光学显微镜难以辨清活体构造。必须借助于固定和染色等理化措施，使样品和背景反射或透射光在波长和振幅上发生变化，即在颜色和亮度上有所差异，以供识别。

相差措施应用于生物学上重要价值，在于它能对透明活体进行直接观测，无需采用使细胞致死固定和染色措施。染色合活体以有害影响，甚至失真。由此，才使相差法显得异常重要。

1．相差

相差是指同一光线通过折身率不一样介质其相位发生变化产生差异。相位是指在某一时间上，光波动所达到位置。

一般由于被检物体（如不染色细胞）所能产生相差差异太小，我们眼睛是很难辨别出这种差异。只有在变相差为振幅差（明暗之差）之后，才能被辨别。

当光波通过两种折射率不一样物质时，如空气→水，或由空气→玻璃，其波长、振幅和相位皆有不一样变化。例如：光波分别通过1cm厚水和1cm厚玻璃时，由于两者折射率不一样，通过它们光波在相位上产生一定差异。通过玻璃光波相位落后，由于玻璃密度和折射率比水大。因此，光波波长和频率都不不小于水。

相差决定于光波所通过介质折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度乘积之差（即光程之差），介质越厚或折射率越大，光波减速也越大。

相差显微镜就是运用被检物光程之差进行镜检。

2．衍射与干涉

用肉眼看不到相差，只要运用衍射和干涉现象，把相差变为明暗振幅差，就也许看到。

（1）衍射

波在同一均匀媒质里传播是沿直线方向进行，假如在它传播方向上，遇到迎面挡住孔或障碍物不比它波长大得多，这时波就会明显绕到障碍物背面或孔外面去（传播路线发生了弯曲），这种现象叫波衍射。

光也有衍射。光通过大小同光波长相差不大细小物体时，也要发生衍射。

（2）干涉

在同一种媒质里传播两列波，假如它们频率和波长相似，在两列波相交区域里，由于叠加成果，每一点合振幅都是一定，并且出现振动加强和振动减弱，这就是波干涉。

光也发生干涉。光波通过小颗粒物体后产生直射光（S）和衍射光（D），衍射光光波振幅小，相位滞后。在光学系统中，这种直射光和衍射光相遇或光叠加，振幅发生变化，光线或明或暗，就是光干涉现象。

假如物体粒子是折射率稍不小于周围媒质极小透明体时，由于光程（折射率和厚度乘积）比较大，因此通过粒子光比周围光在相位上有所推迟。这是由于被检粒子衍射光相位比直射光相位大概迟1/4波长缘故。若是在直射光通过点和大部分衍射光通过面放置吸取光物质或推迟相位物质时，就能分别变化直射光和衍射光相位和振幅。

假如把直射光相位推迟1/4波长，使之与衍射光保持同一相位，合成波（P）等于直射光与衍射光振幅之和，即P=S+D，振幅加大，亮度提高。相反地，把衍射光相位推迟1/4波长，两者相差变成1/2波长，合成波振幅等于两波振幅差，即P=S-D，这时亮度要减弱、变暗。光线相位肉眼是看不到，不过运用衍射和干涉现象把相位差变成振幅差（明暗反差）就能用肉眼识别。图1-2表达直射光（S细线）和衍射光（D虚线）干涉现象。D相位比S被推迟1/4波长。合成波（P粗线）由S与D两者干涉而生成，形成被检物体像，振幅与S相似，相位稍推迟。

图1-2直射光和衍射光干涉

S：细线，直射光；D：虚线，衍射光；P：粗线，合成波。

3．相板作用

为了达到相差效应，在相差显微镜物镜中，装有由光学玻璃制成相板（phaseplate）。在圆形相平面上，有一圈与周围（里外）相板厚度不一样或凸凹圆环。其构造如图1-3。相板分两部分：

（1）共轭面（conjugatearea）：一般为环状，是通过直射光部分。其环是凸起，也也许是凹陷。

（2）赔偿面（complemetaryarea）：共轭面内外两侧部分，是通过衍射光部分。

在相板共轭面或赔偿面上，涂有变化光波相位或吸取光线物质。当光线通过时，使光波相位或振幅变化，从而达到不一样目与观测效果。运用相板把光波相位推迟，振幅变化。相板作用，除推迟直射光和衍射光相位之外，尚有吸取光，从而使亮度变化作用。物镜后焦点位于透镜中间而相板位于物镜后焦面上，因此，相板也安装在透镜中间。

图1-3相板种类及构造

左上：吸取直射光明反差相板平面和剖面图；左下：吸取直射光喑反差相板剖面图；右上：吸取衍射光明反差相板平面和剖面图；右下：吸取衍射光暗反差相板剖面图；黑色：吸取光线层；浅色：推迟相位层；白色：玻璃。

相板种类比较多，对光吸取率高下不一样，因此产生不一样