6第二节-PAGE-生化分析.pptVIP

第二节聚丙烯酰胺凝胶电泳

?

(PolyacylamideGelElectrophoresis,PAGE);

按其电泳装置和凝胶的形状可分为：

垂直管状电泳（圆盘电泳）

垂直板型电泳

;2.按其凝胶的组成系统可分为;二、凝胶聚合的原理及有关特性

1．聚合反应

凝胶的聚合常用过硫酸铵(AP)为催化剂，四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。此外，核黄素亦可为催化剂，聚合需光照，故使用不多。

;(2)凝胶浓度与孔径的关系

一般来说，凝胶浓度越大，孔径越小，移动颗粒穿过网孔阻力越大。反之孔径越大。

;(3)凝胶浓度与被分离物相对分子质量的关系;3．影响凝胶聚合的因素

（1）Acr及Bis的纯度

如试剂不纯，含有杂质或丙烯酸时，则凝胶聚合不均一，或聚合时间延长甚至不聚合。;(2)AP、TEMED

一般AP溶液仅能存放一周。

TEMED为淡黄色油状液，原液应密闭贮存

于4℃冰箱中。增加AP和TEMED可加快聚合速

率，但过量的AP和TEMED会引起电泳时烧胶和

谱带变形。;（3）电位梯度的不连续性;（4）pH的不连续性;3．电荷效应

蛋白质混合物在凝胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多的，泳动的快，反之则慢。因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的区带。在进入分离胶中时，此种电荷效应仍起作用。;四、SDS—PAGE电泳原理;SDS是阴离子去污剂，在水溶液中，以单体和分子团的混合形式存在，由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。;五、凝胶电泳的操作要点;