拟南芥T-DNA插入突变.pptVIP

拟南芥T—DNA插入突变体的鉴定;1、反向遗传学;研究基因功能的方法;2、反向遗传学的重要手段——T-DNA插入突变技术;农杆菌质粒;转化过程示意图;3、反向遗传学方法研究赤霉素糖苷转移酶基因;（1）研究背景;拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。

植物特点：

(1)?生长周期短,6周内完成;

?(2)?基因组小,仅有5?条染色体,113?亿个碱基对,但是它的大多数基因与其他“复杂”的植物基因具有很高的同源性，

?(3)?具有双子叶植物的所有特性

?(4)?有效的农杆菌介导转化途径,易获得大量的突变体和基因组资源;

?(5)?在有限的空间内可大量种植，体形小,?占地少

(6)?收获大量的种子，每株拟南芥可产生多达5000?粒种子；

(7)?生活力强，用普通培养基就可作人工培养。;;实验方案设计;点击进入基因序列信息网页;输入种子基因型号;点击进入基因序列网页;基因序列网页;查找突变体及引物设计;输入基因型号;查看含有相关基因的种子信息;引物设计;中间引物的设计;两侧引物的设计;2、实验材料;

;“三引物法”即采用三个引物（LP、RP、LB）进行PCR扩增。;双引物法;;4.3电泳并观察结果

配制琼脂糖凝胶，将扩增后的样品加入凝胶孔电泳，电泳后观察结果。

;5.结果分析;（4）表型鉴定;用PCR筛选出突变纯合体后，便可以利用反向遗传学的思路对纯合突变体进行一系列的基因功能的研究。基因敲除所产生的突变表型，是该基因缺失后的表型，因而直接表明了该基因的功能与表型的关系，人们由此可以直接快速的检测得到基因的功能。

然而，有很多基因敲除突变体没有很明显的表型作用。;表型不明显的原因;表型鉴定应对策略;Knock-knock突变体;突变-表型;表型鉴定的一般思路;4、T-DNA的研究方向与价值;局限性：

①利用T-DNA插入突变体研究新基因，要求创建饱和突变体库，需要进行大规模的转基因工作，因此实验材料需要具有完善的遗传转化体系（水稻、拟南芥等模式生物）。

②T-DNA转移和整合机制尚不清楚，有时会出现多拷贝插入，且容易产生直接的串联、反向重复和边界缺失等。

;Ourteam;;拟南芥幼苗的??植;;;移植后幼苗的培养;;;CTAB法提取拟南芥DNA;

(1)将10mLCTAB分离缓冲液加入50mL离心管中，置于60°C水浴中预热。

(2)称取1.5g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。

(3)取1g粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。

(4)样品于65℃保温30分钟。

(5)加等体积（10mL）的氯仿-异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀

(6)室温下4000rpm离心10分钟。

(7)用滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使核酸沉淀下来。

（有些情况下，这一步可以产生用玻璃棒搅起来的长链DNA，或者是云雾状的DNA，如果看不到DNA，样品则可以在室温下放置数小时甚至过夜）。

;CTAB法提取拟南芥DNA;异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。可以降低表面张力，从而减少气泡产生。有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。;;方法二;方法二;4.2T-DNA插入突变纯合检测（PCR鉴定）;电泳检测