基因工程(基因工程的主要技术与原理-核酸分离-电泳).pptVIP

生物技术专业核心课程;F基因的化学合成;

;人;细胞器DNA:主要指线粒体DNA和叶绿体DNA,是真核

生物所特有的染色体外遗传物质，分别含有与呼吸

作用和光合作用相关的基因。可用于分离目的基因

和构建克隆载体。;藻类;病毒和噬菌体DNA:主要用于构建基因克隆载体，

可承载较大片段的外源DNA。;DNA提取的一般程序;3.其它方法：;植物总DNA的提取;为了尽可能获得大分子量的DNA，一般采用去污

剂温和处理法，对于细胞破碎较困难的植物材料，

可以辅加蛋白酶K，在酶的存在下共同破碎细胞。;1.CTAB法原理;CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide,十六烷

基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，能

与核酸形成复合物；;2.SDS法原理;SDS法操作简单、温和，也可提取到高分

子量的DNA，但所得产物含糖类杂质较多。;4.基因组总DNA法提取程序;5)将上清液转入另一离心管，加入等体积

异丙醇（或两倍体积冷乙醇），混匀，冰

浴20-30min，沉淀DNA；;DNA电泳结果;大肠杆菌质粒DNA的提取;碱裂解法提取E.coli质粒DNA程序及原理;4.将细菌沉淀重悬于200μl冰预冷的溶液I中，

剧烈振荡；;6.加入300μl冰预冷的溶液III，后温和振荡

10秒钟，混匀后，置于冰上3-5min；;14.风干后，溶于20-50μlTE缓冲液或无菌

双蒸水中；

15.加入适量无DNA酶的RNase(20μg/ml)，

37℃处理30min；

16.琼脂糖凝胶电泳检测后，-20℃贮存备用。;质粒DNA电泳结果;二、RNA的分离和纯化;（一）控制潜在的RNA酶活性;电泳用具：最好专用；用前洗涤剂清洗干净，再用

3%H2O2和0.1%的DEPC水浸泡后，冲洗干净方可使用。;（二）RNA的抽提和纯化;2)??硅胶膜纯化法：;（三）mRNA的纯化;RNA电泳结果;三、核酸的评价;2.核酸浓度估算：;(NucleicAcidGelElectrophoresis);优点：

（1）便于分离；

（2）便于检测；

（3）便于回收。;一、核酸凝胶电泳的基本原理;一、琼脂糖凝胶电泳

Agarosegelelectrophoresis;（一）凝胶的制备及电泳;琼脂糖凝胶制作过程;;;;（二）DNA的迁移速率决定因素;2.琼脂糖浓度和种类;不同类型琼脂糖的性质;不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围;3.凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭

溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷

减少、刚性和长???增加。;缓冲液;TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较;（三）凝胶载样缓冲液;6×凝胶载样缓冲液;指示剂:;（四）琼脂糖凝胶中DNA的检测;1.凝胶的EB染色;EB的染色原理;使用EB染色注意事项;2凝胶SYBRGold的染色;（五）凝胶中DNA的成像;GelDoc2000SystemsandAccessories;（六）凝胶中DNA的回收;二、聚丙烯酰胺凝胶电泳

polyacrylamidegelelectrophoresis

PAGE;在四甲基乙二胺(TEMED)催化过硫酸铵还原产生的

自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚

丙烯酰胺的线状长链。;CH2=CH-C(O)-NH2

(丙烯酰胺）

CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2

（N，N`-亚甲双丙烯酰胺）;（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳种类;2.非变性聚丙烯酰胺凝胶;（三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围;聚丙烯酰胺凝胶装置;三、脉冲场凝胶电泳

pulsed-fieldgelelectrophoresis

PFGE;（一）PFGE工作的基本原理;B+;（二）PEGE类型;A-;（三）影响分辨率的因素;3.电场夹角：电场方向的夹角常为1100-1200，

研究证实900夹角也非常有效的。;本节要点：