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血清学筛选噬菌体

1.预备NZYagarplates（至少用前24小时倒好），用前在37℃培育箱中烘烤1-2小时以去除水滴。

2.将过夜培育的XL1-blueMRF细菌2000转/分，离心10分钟，将细菌溶解在10mMMgSO4中，调整细菌浓度为OD600=0.5。

3.溶化NZYtop，并将NZYtop放在50℃水浴中。

4.将适量的XL1-blueMRF细菌溶液与肯定稀释度的phage文库混合，37℃下共同作用15分钟。

①直径90mm平板：200lXL1-blue细菌+适量的phage文库

②直径150mm平板：600lXL1-blue细菌+适量的phag文库

（噬菌斑数量一般保持在3000pfu/90mm;12000pfu/150mm）

5.将步骤4中的混合液与NZYtop溶液混合（200l混合液+3-4mlNZYtop溶液；600l混合液+8-10mlNZYtop溶液），倒入到NZYagarplates中，室温下放10分钟左右，然后倒置放于37℃下培育。

6.当噬菌斑刚好可看到时（大约5-8小时），从培育箱中拿出平板。

7.将NC放入10mMIPTG溶液中完全浸湿，在空中使膜沥干，并做好3个不对称的标记。

8.将IPTG处理好的NC贴在平板上，不留气泡，然后倒置放于37℃下培育。

9.过夜培育后，其次天早上取出平板，用镊子将膜轻轻掀起，留意不要将培育基粘在膜上。

10.将膜放于50mlTBST溶液中，水平脱色摇床上震荡洗膜3次，每次10分钟。

11.将膜放入50ml封闭液中，水平摇动，封闭4-6小时。

12.在封闭液中加入适当滴度的一抗，水平摇动处理过夜。

13.将膜放于50mlTBST溶液中，洗膜3次，每次10分钟。

14.在封闭液中加入适当滴度的二抗（各个公司的二抗使用滴度不同），室温水平摇动1-2小时。

15.将膜放于50mlTBST溶液中，洗膜3次，每次10分钟，最终用50mlTBS溶液洗膜15-20分钟，取出膜空气中沥干。

16.将膜放入BCIP-NBT显色液中避光显色，水平摇动直到阳性斑点可见为止。

17.从显色液中取出膜放在TBS溶液中，空气中使膜干燥。

18.依据所做的标记，将膜与平板对齐，将平板上对应的阳性克隆区域的培育基挖出放入500lSMbuffer中，并加入25mlchloroform，4℃贮存（最多可贮6月）。

19.第一轮筛选得到阳性克隆需要进行其次轮筛选以去除假阳性并获得阳性单克隆噬菌体。过程如第一轮筛选，只不过用直径90mm平板；详细过程见步骤4，这时所加入的噬菌体溶液是第一轮筛选得到的噬菌体上清（见步18骤），

在用前要滴定好噬菌体的滴度，噬菌斑的数量以可区分出单个克隆，同时密度不能太稀为标准（一般100-200pfu/90mm）。

20.按第一轮相像的过程进行试验，最终显色，确定真正的阳性克隆，并将阳性单克隆所在的培育基挖出放入500lSMbuffer中，并加入25mlchloroform，4℃贮存（最多可贮存6月）。

留意：

1.封闭液一般可用：5%的脱脂牛奶或1%的BSA溶解在TBST溶液中。

2.第一轮筛选用150mm的平板；其次轮筛选用90mm的平板，一般需要筛选至少1x106pfu。

3.仔细做好三个不对称的标记，特殊在其次轮选择阳性克隆时要认真将膜与平板吻合好，不能挑错。