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探索嵌合1a与1b亚型包膜蛋白基因的HCV细胞培养模型构建与特性研究

一、引言

1.1研究背景与意义

丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus，HCV）是一种单股正链RNA病毒，作为导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要病原体之一，给全球带来了沉重的医学、社会和经济负担。据世界卫生组织统计，全球约有7100万人感染了HCV，其中50%-70%的感染者在初期往往没有明显的临床症状，这使得他们在不知情的情况下成为了病毒的传播源，进一步加剧了疾病的扩散。

HCV主要通过血液传播、性接触传播和母婴传播，对感染者的健康造成了严重威胁。若不及时治疗，丙肝病毒的长期活跃复制会反复损伤肝细胞，导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，严重时危及生命。同时，丙型肝炎还可能引发肝外疾病，如类风湿性关节炎、眼口干燥综合征、扁平苔藓、肾小球肾炎等，极大地影响患者的生活质量。尽管目前已经有了针对HCV的直接抗病毒药物（DAAs），能够有效治疗丙肝，治愈率在95%以上，但随着病毒的不断突变和优化，其对药物的敏感性逐渐减弱，这使得研发新的药物和疫苗迫在眉睫。

HCV基因组分为7个基因，其中1a和1b亚型是世界上最常见的两种亚型，占全球感染病例的78%。包膜蛋白基因E1和E2编码HCV的包膜蛋白，这些包膜蛋白在病毒入侵宿主细胞和逃避免疫监视的过程中发挥着关键作用，是HCV感染过程中最重要的分子靶点，也是HCV免疫预防和治疗的主要目标。研究HCV不同亚型包膜蛋白基因的功能和相互作用，有助于深入了解病毒的感染机制，为制定更加有效的预防和治疗策略提供坚实的理论基础。

细胞培养模型作为研究病毒感染和复制过程的重要工具，在病毒学研究中具有不可或缺的地位。通过构建HCV细胞培养模型，我们能够在体外模拟病毒的感染环境，深入研究病毒与宿主细胞之间的相互作用。近年来，各种新型的细胞培养技术不断涌现，如co-culture技术和organoid技术等，为构建更加精准、有效的HCV细胞培养模型提供了新的可能。基于现有的细胞培养技术，构建嵌合1a与1b亚型包膜蛋白基因的HCV细胞培养模型，研究其在宿主细胞上的感染和生长特性，不仅可以为HCV病毒的病理生理机制和基因调控机制的研究开辟新的思路，还能为开发新的治疗药物和疫苗提供重要的实验依据，对推动丙型肝炎的防治工作具有重要的现实意义。

1.2国内外研究现状

在HCV细胞培养模型构建方面，国内外学者进行了大量的研究。早期，由于HCV在被感染组织和血清中浓度较低，且具有高度变异的特点，缺乏稳定的体外细胞培养系统及理想的实验动物模型，这在很大程度上阻碍了对HCV的深入研究。随着研究的不断深入，国外学者在感染模型和转染模型方面取得了一定的进展。

在感染模型方面，1992年，Shimizu等尝试用肝细胞株建立支持HCV复制的体外模型，但遗憾失败。1994年，Lanford等用含多种生长因子和激素的无血清培养基，成功在体外长期培养成年黑猩猩的肝细胞，并用HCV阳性的病人血清感染培养细胞，从感染后的第4天一直到第25天，细胞内HCVRNA正链、负链都能被检测到，且HCV在黑猩猩肝细胞中的复制能够被α-干扰素（α-INF）所抑制。Ito等用慢性丙型肝炎病人的原代肝细胞建立复制HCV体外培养系统，通过竞争PCR对培养细胞及培养上清中HCVRNA正、负链进行定量检测，证实了原代肝细胞体外复制HCV的成功，并且用基因测序的方法比较了培养前后HCVE2/NS1区的核酸序列，发现HCV的生物学特性在体外细胞培养体系中未发生改变。然而，原代肝细胞体外长期培养困难，细胞分化能力有限，不能多次传代，限制了其在HCV体外复制模型中的广泛应用和深入研究。直到1996年，Kato等报道应用非肿瘤形成的人肝细胞系PH5CH培养HCV获得成功，用半定量PCR方法检测细胞及上清中HCVRNA，发现在30d内PH5CH细胞中HCVRNA呈增加趋势。在淋巴细胞系用于HCV细胞模型的研究中，1992年Shimizu等用鼠逆转录病毒感染人T细胞，得到MOLT-4细胞株，当鼠逆转录病毒和HCV共同感染人T细胞时，HCV在细胞中复制效率大大提高。1993年Shimizu等再次报道用鼠逆转录病毒感染人T细胞，获得了HPB-Ma细胞株，并用有限稀释法获得HPBMa10-2克隆，可有效支持HCV复制，最长培养至76d，细胞中仍能检测到负链HCVRN