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基因工程菌

大肠杆菌2

被选为基因工程菌的原因常见易得，易于培养质粒为常用运载体代谢迅速,经济高效基因工程菌的通性3

作为表达外源基因受体菌的优劣比较劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内霉素优势基因克隆表达系统完善全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物4

工程菌高密度发酵工艺自重组DNA技术产生以来，许多在临床上具有重要治疗价值的蛋白药物通过携带有目的基因的大肠杆菌成功地在实验室和工厂得以生产。利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺，生物工程菌发酵的目的是希望能狄得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表达不仅涉及宿主、载体和目的基因二者之间的相互关系，而且与其所处环境条件息息相关，因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的，需要对影响外源基因表达的因素进行分析，探索出适合外源基因表达的发酵工艺。高密度、高产率和高浓度培养是近几年发酵工业的目标和方向。对于大肠杆菌，尤其是重组大肠杆菌的发酵来讲，实现高密度发酵，可相应的缩小生物反应器的体积和降低生物量的分离费用，从而降低生产成本，达到提高生产效率的目的。通过对基因工程菌(RRhPI-pQE40E.coliM15)发酵条件的优化，可以看出摇床转速与补料方式对发酵结果影响最大.摇床转速与发酵过程中氧气的供给有很大的关系。大肠杆菌的生长代谢需要氧气的参与，溶解氧浓度对菌体的生长及重组产物的影响很大，溶解氧的浓度过高或过低都会影响大肠杆菌的代谢，使后期生长变得极为缓慢，而且会降低重组蛋白的表达量.菌体在进行大量的增殖过程中，消耗氧进行氧化分解代谢，因而饱和氧的及时供给非常重要。随着发酵的进行菌体的细胞密度迅速增加，溶解氧的浓度因不断被菌体消耗而降低，细胞的生长开始减慢，ST值下降，尤其在发酵后期，下降幅度更大。在高密度发酵后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参数均不能满足对氧的供给，结果导致外源蛋白的表达量很低。所以维持较高水平的溶氧浓度能提高带有重组质粒的大肠杆菌的生长繁殖，有利于外源基因的重组蛋白的表达。一般的高密度发酵的通风速度达到18L/min(20L发酵罐)，搅拌速度达到500rpm以上，往往还需要供给纯氧，需保持60%以上的溶氧饱和度，这样才能提高带有重组质粒细胞的生长，利于外源蛋白产物的形成。需要注意的是，要考虑通风速度和搅拌速度的增加对泡沫的产生和发酵液粘稠度的影响，需要在培养基中加入适宜的消泡剂。

酵母菌作为基因工程菌的优势酵母菌是最成熟的真核生物表达系统全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简单具有原核生物无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久，技术成熟，工艺简单，成本低廉。能将外源基因表达产物分泌到培养基中不含有特异性的病毒，不产内毒素

传统酵母转化系统先使纤维素酶基因与表达载体相结合，再将重组体转入酵母细胞内形成转化子，表达目的基因，从而产生纤维素酶蛋白，这是传统酵母转化系统。目前有2种方法可以使酵母细胞摄取外源DNA，即原生质体转化和完整细胞转化。现在采用较多的是完整细胞转化的方法，该方法是1983年发展起来的。此方法虽然要用Li离子处理细胞，但和原生质体转化方法相比，则比较简单，在筛选转化子时，不必进行细胞壁再生，而且Li离子处理完整酵母细胞的转化率比原生质体的高。但必须用聚乙二醇处理转化细胞，否则转化率会大幅度下降。9

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酵母表面展示系统12/28/202511

酵母表面展示系统的类型目前，最常见的酵母表面展示表达系统包括:凝集素展示表达和絮凝素展示表达。凝集素展示表达系统是将外源基因与酵母编码凝集素C端编码序列(含GPI锚定信号序列)连接后插入质粒载体的信号肽下游，融合蛋白诱导表达后，信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌，由于融合蛋白C末端存在含GPI锚定信号的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵母细胞壁中，从而将蛋白分子展示表达在酵母细胞表面。絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因与外源蛋白融合，并将融合蛋白展露表达在细胞表面，此系统又包括两个子系统:GPI锚定系统和絮凝结构域锚定系统。GPI锚定系统是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源蛋白，此系统与凝集素展示相似;絮凝结构域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能结构域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并非共价作用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物。

酵母表面展示与酶技术酶的固定化是指借助物理或者化学方法将酶固定于特殊的相，使得酶与整体流体分开，但是仍