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细胞因子与细胞黏附因子的测定

第一节生物学测定方法

常见的生物学测定法包括：基于DNA检测的分子生物学测定法和生物活性测定法。

前者有细胞因子或细胞黏附分子DNA扩增法、RNA印迹法、原位杂交法、核酸酶保护分析等，可定性或定量分析细胞因子和细胞黏附分子的基因或mRNA。

后者则是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测方法，主要用于细胞因子的测定。

生物活性测定法的基本原理，是根据不同细胞因子所具有的某一方面独特的生物学活性，构建发挥这一活性的反应体系，通过观察其活性作用的结果，判断有无相应细胞因子的存在。

有助于细胞因子检测的活性作用大致有以下几类：

1.刺激细胞增殖或集落形成的活性；

2.维持细胞生长和存活的特性；

3.抑制细胞生长或破坏细胞的效应；

4.促进细胞趋化或抗病毒作用等。

一、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法

1.直接计数法

2.细胞代谢活性测定方法

3.细胞代谢产物测定法

常用放射性核素掺入法和MTT比色法

二、细胞毒活性测定法

对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。因此，待测细胞因子做一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性成正比。

本法常用于TNF等的测定。

三、抗病毒活性测定法

抗病毒活性测定法主要用于IFN等细胞因子的检测。

四、趋化活性测定法

其诱导细胞迁移的方式包括趋化性和化学增活性。

趋化性可采用琼脂糖和Boyden盲端微孔小室趋化试验测定。

化学增活性可采用琼脂糖小滴化学动力学试验测定。

五、生物学活性测定方法学评价

细胞因子生物学活性测定法主要具有以下特点：

1.敏感性较高

2.特异性不高

3.操作繁琐

4.易受干扰

第二节免疫测定方法

一、ELISA方法

双抗体夹心法是用于细胞因子测定的最常用方法。

细胞因子测定的标本主要包括两大类，一是血清（血浆）、关节液、胸腔液、脑脊液或腹腔液等体液，可用于细胞因子和可溶性黏附分子的检测；二是细胞体外培养后的培养上清液，只用于细胞因子的检测。

二、流式细胞分析法

流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。

该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面黏附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或黏附因子的检测，精确判断不同细胞亚群的细胞因子和膜分子的表达情况。

根据荧光抗体的性质，荧光抗体染色分直接法和间接法，前者使用荧光标记的细胞因子或黏附分子的特异性抗体，后者则用荧光标记二抗。直接法较为常用，其敏感性虽不及间接法，但特异性强。

该法检测细胞内细胞因子时，主要包括以下基本步骤：

1.分离和培养待检细胞。

2.细胞固定常用的细胞固定剂为4%多聚甲醛。

3.封闭非特异性结合位点即用含5%脱脂奶粉和钙、镁离子的PBS溶液，重悬已固定的细胞。

4.染色与分析即用荧光素标记的细胞因子特异性单克隆抗体做荧光抗体染色，用流式细胞仪分析荧光阳性细胞百分比和荧光强度。此外，若应用不同荧光素标记两种以上细胞因子的单克隆抗体，则可同时检测同一细胞内2种以上不同的细胞因子。

应用此法还可区分具有不同分泌特性的细胞亚群，如Th1、Th2细胞等。

三、酶联免疫斑点试验

酶联免疫斑点试验（ELISPOT），源自ELISA，但又突破传统ELISA，是定量测定抗体形成细胞技术的延伸和发展，已被愈来愈多地应用于类风湿因子、IFNγ等细胞因子分泌细胞的定量测定。

其基本原理是：在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，在有或无刺激物存在的条件下培养后，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。

细胞因子或其他可溶性分子分泌细胞的检测方法，能从20万～30万个细胞中检测出1个分泌相应分子的细胞。

四、免疫学测定方法学评价

①特异性高，使用特异的单克隆抗体，可用于单一细胞因子的检测。

②操作简便、快速，无需依赖细胞株，故不需维持培养，使方法的可操作性大大增加，容易推广和便于普查。

③影响因素相对较少且容易控制，重复性好，方法容易标准化。

优点：

①所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定成正比。

②测定结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系，使用不同来源亲和力的单抗，对同一标本测到的结果可能不同。

缺点：

③敏感性相对较低，比生物活性法约低10～100倍，测定下限一般为100pg。

④若标本中存在细胞因子的可溶性受体，可能会影响特异性抗体对细胞因子的结合。

第三节细胞因子与细胞黏附分子测定的临床应用

细胞因子的测定主要用于以下几方面：

1.特定疾病的辅助诊断；

2.机体免疫状态的评估；

3.临床疾病治疗效果的监测和指导用药；

4.疾病预防的应用。

一、临床应用原则

1.方法的联合应用

2.标