实验二-SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量.pptVIP

实验二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

（SDS）测定蛋白质相对分子质量;一、实验目的

二、实验原理

三、实验步骤;一、实验目的;什么是电泳？;影响带电粒子在电场中泳动的因素;3．电场强度：

电场强度指每单位介质长度的电位梯度（又称电位差或电位降）。

一般而言，电场强度越大，电泳速度越快。

但随着电场强度的增大会引起通过介质的电流强度增大，从而造成电泳过程产生的热量增多，最终导致介质温度升高。降低电流强度，可以减少产热，但会延长电泳时间，引起生物大分子扩散增加，同样影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度。;4．电渗：

液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。

由于支持介质表面存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基，琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动。

当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度；当电渗方向与电泳方向相反时，则降低电泳速度。;电泳技术的分类;电泳示踪剂;蛋白质变性

0.1-1%SDS

0.1Mbeta-巯基乙醇

蛋白质与SDS分子按比例结合

1：1.4;SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具有相同的荷质比，因此在SDS中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系;丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小（1～100μg）、分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或与交联剂的比例聚合成不同大小孔径的凝胶。可用于蛋白质、核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析；还可结合解离剂十二烷基硫酸钠（SDS）以测定蛋白质亚基的相对分子质量。;聚丙烯酰胺凝胶性质;聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种：

（1）化学聚合：通常采用过硫酸铵(AP)为催化剂，四??基乙二胺（TEMED）为加速剂。在TEMED催化下，过硫酸铵可使丙烯酰胺单体的双键打开、活化形成自由基丙烯酰胺，从而引发聚合作用。

（2）光聚合：通常采用核黄素作催化剂，核黄素在光照下光解成无色基，后者再被氧化成自由基而引发聚合作用。光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定。化学聚合的凝胶孔径较小，且各次制备的重复性好。故一般采用化学聚合。;三、实验步骤;分离胶的制备;浓缩胶的制备;;牛血清白蛋白;三加样;四电泳;五剥胶;六染色和脱色

;七、Mr的计算;八转膜

胶放在3张缓冲液浸湿的滤纸上，盖上经甲醇激活（15-30sec）的PVDF膜（切多余的膜及纸，与凝胶一样大小）排气泡，盖同样3张缓冲液浸湿的滤纸，排气泡。

顺序：

负极－3层滤纸－凝胶－膜－3层滤纸－正极，如图。

用塑料夹夹紧，放入转移电泳仪，电泳槽搁置冰上，恒压１小时。丽春红染色1分钟检测目标蛋白。

九封闭

PVDF膜用TBST淋洗，放入封闭液中

;蛋白转膜组装顺序（sandwich制作）;醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质;【操作步骤】;二、电泳

将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面（即点样面）向下，点样端置于阴极（切勿弄错）。槽架上四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸桥需贴紧并拉直，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放多张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，待平衡5分钟后通电，电压为10V/cm长（指膜条与滤纸桥总长度），电流为0.4～0.6mA/cm宽，电泳时间约1小时左右。

三、染色

通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分钟取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。