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基于新一代测序技术的microRNA生物信息学分析与平台构建：方法、应用与展望

一、引言

1.1microRNA概述

在生命科学的微观世界中，基因表达调控如同一场精密的交响乐，而microRNA（miRNA）则是其中至关重要的音符。microRNA是一类内生的、长度约21-23个核苷酸的非编码单链小分子RNA，广泛存在于从植物、线虫到人类等多种真核生物中。尽管其长度较短，却蕴含着巨大的生物学功能。

从结构上看，成熟的microRNA具有独特的特征，其5’端为磷酸基团，3’端是羟基，没有开放阅读框，是非编码RNA家族中的重要成员。这种特殊的结构使其区别于其他编码RNA，为其在基因表达调控中的独特作用奠定了基础。

miRNA的生物合成是一个复杂且有序的过程。首先，在细胞核内，miRNA基因在RNA聚合酶II的作用下转录生成初级miRNA转录本（pri-miRNA），pri-miRNA通常具有较长的序列，包含一个或多个miRNA前体序列，形成具有茎环结构的RNA分子，宛如一条精心编织的丝带，其中的茎环结构为后续的加工提供了关键的识别位点。随后，pri-miRNA在核酸酶Drosha和双链RNA结合蛋白Pasha（在哺乳动物中为DGCR8）组成的复合物作用下，被切割成约70-100个核苷酸长度的前体miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA依旧保持着茎环结构，就像是从长丝带中裁剪出的特定片段，保留了关键的结构特征。接着，pre-miRNA在转运蛋白exportin-5和Ran-GTP的协助下，从细胞核转运至细胞质中。在细胞质中，pre-miRNA会被另一种核酸酶Dicer识别并切割，最终产生长度约为21-23个核苷酸的成熟miRNA双链，至此，miRNA完成了从初始转录本到成熟分子的华丽转变。

在基因表达调控中，miRNA发挥着举足轻重的作用。其主要通过与靶mRNA的3’非翻译区（3’-UTR）进行不完全互补配对，从而抑制靶mRNA的翻译过程，或者诱导靶mRNA的降解。这一调控机制犹如精准的“分子开关”，在细胞的生长、分化、凋亡、代谢等诸多生物学过程中发挥着不可或缺的作用。在细胞分化过程中，特定的miRNA可以通过抑制相关基因的表达，促使细胞朝着特定的方向分化，确保组织和器官的正常发育；在疾病发生发展方面，miRNA的异常表达与多种疾病密切相关，如肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等。在肿瘤中，某些miRNA可能作为癌基因促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，而另一些则可能作为抑癌基因抑制肿瘤的发生发展。

1.2新一代测序技术

随着生命科学研究的不断深入，对基因信息获取的需求日益增长，新一代测序技术应运而生，它的出现宛如一场革命性的风暴，彻底改变了基因测序领域的格局。新一代测序技术，又被称为高通量测序技术，是对传统桑格测序技术的重大突破。与传统测序技术相比，新一代测序技术能够在一次实验中同时对大量的DNA分子进行平行测序，实现了大规模、高通量的数据产出，极大地提高了测序效率，降低了测序成本。

新一代测序技术的原理基于多种创新性的方法。以Illumina测序平台为例，其采用的是边合成边测序（Sequencing-By-Synthesis，SBS）技术。在测序过程中，首先将DNA片段化，并在两端连接上特定的接头序列，构建成DNA文库。然后，文库中的DNA片段会与芯片表面的引物进行杂交，并通过桥式PCR进行扩增，形成DNA簇，每个DNA簇都含有数千个相同的DNA拷贝。接下来，在测序反应中，带有荧光标记的dNTP会按照碱基互补配对原则依次添加到新合成的DNA链上，每添加一个dNTP，就会释放出一个荧光信号，通过检测荧光信号的颜色和强度，就可以确定相应的碱基序列。这种边合成边测序的方式，就像是在搭建一座精密的分子大厦，每一块“砖头”（dNTP）的添加都伴随着一个明确的信号，从而精确地记录下DNA的序列信息。

除了Illumina平台，常见的新一代测序平台还有Roche454测序平台和ABISOLiD测序平台。Roche454测序平台利用焦磷酸测序原理，将DNA文库的片段固定在磁珠上，通过乳液PCR进行扩增，然后在测序反应中，当dNTP与模板链结合时，会释放出焦磷酸，焦磷酸在一系列酶的作用下转化为ATP，ATP会促使荧光素酶催化荧光素发光，通过检测光信号来确定碱基序列，其过程就像是一场微观世界的化学反应，每一个碱基的结合都引发了一个可检测的光学信号。ABISOLiD测