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腺病毒感染滴度测定（CCID50法）

C.1材料

检定用HEK293细胞（在限定代次内）；参比品（内部质控品）；DMEM培养基、胎

牛血清（FBS）、青霉素-链霉素（可选）、0.25%胰酶-EDTA。

C.2仪器设备

生物安全柜、CO培养箱、恒温水浴锅、细胞计数仪、倒置显微镜。

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C.3操作步骤

C.3.1细胞准备

取形态正常且汇合度达到80%以上的HEK293细胞，消化计数，将细胞悬液稀释至1×105

个/ml，100μl/孔加入96孔板中，置于37℃、5%CO培养箱内培养20h±2h。

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C.3.2样品接种

于生物安全柜中，用无血清DMEM培养基将样品及参比品进行适当稀释，以参比品

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（5.0×10VP/ml）为例，将参比品连续10倍稀释至10倍，后作2倍稀释至5.12×10倍。

弃去孔中旧培养基，向96孔板中从低到高加入后8个稀释度的供试品/参比品，200μl/孔，

每个稀释度接种10个平行孔，第一列和最后一列作为阴性对照孔加无血清DMEM，在37℃，

5%CO条件下孵育60分钟。吸出各孔内上清液，加入200μl/孔5%FBS的DMEM培养液，

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在37℃5%CO条件下持续培养10天。

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C.3.3结果观察

从接种供试品起第8天至第10天，每日逐行观察细胞病变的情况，并计数最终细胞病

变孔数。阴性对照无任何细胞病变且生长状态良好，低稀释度细胞100%病变而最高稀释度

细胞100%不病变，则判定本次试验结果有效。

C.3.4结果计算

将发生细胞病变孔的比率为20%～80%（即在同一稀释度所发生细胞病变的孔数为2～

8个）的稀释度代入下式进行计算。每毫升感染效价(IU/mL):

1/2

V=-[(ln(1-Pw/n))×D]/(Aw×Cw×I×t)

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公式中Pw/n为阳性孔比率，D为稀释度，Aw为96孔板每孔面积（cm），0.33cm，

-41/2

Cw为接种供试品前细胞汇合度，I为扩散系数2.38×10cm/s，t为病毒感染时间（s）。将

计算结果取平均值，即为供试品病毒滴度检测结果。

C.3.5结果判定

C.3.5.1阴性对照

阳性孔比例为0%

C.3.5.2参比品

最低稀释度阳性孔比例为100%，最高稀释度阳性孔比例为0%，滴度回收率应符合要

求。

（回收率实测值/理论值×100%，理论值为至少15次标定的结果。）

C.3.5.3供试品

最低稀释度阳性孔比例为100%，最高稀释度阳性孔比例为0%

C.3.5.4以上条件均符合则结果可输出。