（100页PPT）核酸和核酸的合成2zzh.pptVIP

PstIProvindenciastuartii164CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd常见限制性核酸内切酶的酶切位点酶切反应步骤＋－电泳紫外分析37℃1h加反应液CKMBuffer(10X)2.0?LDNA0.2~1.0?gEnzyme1～2U＋ddH2O至20.0?LCKMTT酶切反应体系marker核酸的研究方法一、核酸的分离、提取通则为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点：1．保持低温（0o～4℃）。2．防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。3．防止核酸酶的作用。抑制DNase：可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。抑制RNase：（1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethylpyrocarbonate,DEPC）处理。（2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。（3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制剂。二、大分子DNA的提取1．材料的选择2．细胞破碎3．DNA-蛋白质（DNP）的提取真核细胞DNA与蛋白质结合成核蛋白（DNP），RNA与蛋白质结合成RNP，而且DNP和RNP常常混在一起。利用DNP和RNP在不同浓度NaCl中溶解度的不同来分离DNP和RNP。可用1mol/LNaCl溶液提取DNP。相对溶解度NaCl（mol/L）DNP在NaCl中的溶解度4．去蛋白质（1）SDS（2）苯酚法（3）氯仿法（4）酚:氯仿:异戊醇＝25:24:15．沉淀DNA6．去杂质（1）去RNA（2）去多糖7．进一步纯化生物材料DNP（RNP）DNP纤维状DNA较纯DNA纯DNA*原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。破细胞1.0mol/LNaCl*去蛋白质酒精沉淀去RNA柱层析，电泳密度梯度离心去多糖三、RNA的提取1．不同种类RNA的提取2．大分子RNA的提取（1）酚提取（2）酚-氯仿-SDS法3．mRNA的提取Southern印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探针杂交放射自显影带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜原位杂交也叫菌落原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。是直接菌落或噬菌斑为对象来检测重组子的技术。原位杂交限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因组D的构建对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。原位杂交筛选核酸分子杂交的应用研究DNA分子中某一种基因的位置定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础基因芯片技术快速、高通量、平行化、自动化指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量基因探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）基因芯片技术1..芯片的制备Geneprobes（cDNA、DNA）substrateReady-to-usemicroarrayOligoprobesAGCTorarrayerSamplecellsExtractRNAorDNA2)RTorPCRamplification3)FluorescentlabelingReferencecellsSamplereadybineLabeledRNAorDNA(Sample)Labeled