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合欢种子凝集素：从分离鉴定到基因克隆的深度解析

一、引言

1.1植物凝集素研究综述

1.1.1凝集素的发现与定义演变

凝集素的发现可追溯至1888年，Herman和Stillmark首次在蓖麻萃取物中发现了具有凝集红细胞作用的物质，这便是最早被发现的凝集素。此后，随着研究的不断深入，Renkonnen发现这类物质对血细胞凝集具有选择性。1919年Sumner从豌豆中分离出结晶蛋白并命名为ConA，第一次获得了纯的凝集素。1936年Sumner和However报道ConA可以凝集血细胞和酵母细胞，还能沉淀糖原，并揭示了其糖特异性。随着对红细胞凝集反应中血型特异性认识的加深，Watkin和Morgan建立了人类ABO血型系统凝集反应中严格的糖特异性结合理论。Goldstein给出了凝集素第一个较确切的定义：凝集素是自然界广泛存在的一类能凝集细胞、多糖或糖复合物的非源于免疫反应的糖蛋白。1980年，Nature杂志发表的联名信提出了更具权威性的定义，强调凝集素是非免疫来源的糖结合蛋白或糖蛋白，应有使细胞凝集或糖复合物沉淀的能力，且分子必须具有两个或更多糖结合位点，这一定义将一些虽有糖结合能力但糖结合位点仅有一个的酶、转运蛋白、激素、毒素等排除在外。如今，凝集素被定义为一类具有糖结合专一性，可促使细胞凝集的蛋白质，广泛分布于植物、动物和微生物中。

1.1.2植物凝集素的分布与命名分类

植物凝集素分布广泛，在高等植物中约有14%的植物含有植物凝集素，其中蝶形花科中比例高达43%，禾本科中比例达12%。不仅种子中存在凝集素，根、茎、叶、皮、果汁等部位也有发现。其命名分类方式多样，根据来源可分为植物（包括细菌、真菌等微生物）凝集素和动物凝集素，也有称前者为外源性凝集素，后者为内源性凝集素；根据在细胞中存在的部位可分为可溶性和膜结合两类，前者主要存在于胞浆，核质中也有；根据单糖对凝集素活性的抑制作用来研究凝集素的糖结合专一性，可分为6类：与D-甘露糖(或)D-葡萄糖结合；与2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖结合；与2-乙酰氨基-2-脱氧-D-半乳糖结合；与D-乳糖结合；与L-岩藻糖结合；与唾液酸结合。

1.1.3植物凝集素的性质与功能

植物凝集素具有多种理化性质，其分子量变化范围约为10kDa-100kDa，亚基数目为2-4个。从结构上看，凝集素是由二至四个亚单位的寡聚蛋白，个别植物凝集素分子的亚单位可达十八个，通常每个亚单位有一个能与糖结合的位点，通过疏水键和氢键在含糖的微分子之间起连接作用。它能特异性识别并可逆结合复杂糖复合物中的糖链，而不改变所结合糖基的共价键结构。

在功能方面，植物凝集素在细胞凝集、免疫调节、抗病毒、抗癌等方面发挥着重要作用。在细胞凝集方面，它可促使细胞凝集；在免疫调节中，能激活小淋巴细胞转化为淋巴母细胞，继而分裂增殖，释放淋巴因子，并提高巨噬细胞的吞噬功能。作为干扰素诱导剂可以刺激机体产生白介素-2和干扰素，还可以刺激机体产生非特异性抗体。在抗病毒和抗癌领域，对病毒侵袭的细胞有杀伤作用，在体外能抑制人体食管癌及肝癌细胞株，对艾氏腹水癌亦有抑制作用。此外，植物凝集素还能抵御植物病原菌的侵害，对真菌而言，它能结合真菌细胞、抑制孢子萌发和菌丝体生长，如麦胚凝集素（WGA）抑制绿色木霉的孢子萌发和菌丝生长；对细菌，虽不能进入细菌细胞质改变细胞膜结构或渗透细胞膜，但可通过与细胞壁糖类或细胞外聚糖相互作用来对细菌构成抗生效应，如马铃薯凝集素能抗青枯假单胞菌；对昆虫，可通过和糖蛋白结合，影响昆虫对营养的吸收，抑制昆虫的生长发育和繁殖，如雪花莲凝集素（GNA）等对咀嚼式昆虫和刺吸式昆虫都有致死作用。

1.1.4植物凝集素的分离及基因克隆进展

在植物凝集素的分离技术上，常用的方法包括盐析、凝胶过滤层析、离子交换层析等。盐析法利用不同蛋白质在不同浓度盐溶液中的溶解度差异来分离蛋白质，如采用硫酸铵沉淀可初步分离合欢种子中的凝集素。凝胶过滤层析则根据分子大小不同进行分离，分子大的先流出，分子小的后流出。离子交换层析利用蛋白质表面电荷与离子交换剂的相互作用进行分离，通过改变洗脱液的离子强度和pH值来实现不同蛋白质的洗脱。这些方法常常结合使用，以提高凝集素的纯度。

在基因克隆方面，主要采用RT-PCR和RACE相结合的方法。RT-PCR即逆转录聚合酶链式反应，先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，可获得目的基因的部分片段。RACE即cDNA末端快速扩增技术，用于扩增已