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产柠檬酸黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因敲除及其对代谢途径的影响探究

一、引言

1.1研究背景与意义

黑曲霉（Aspergillusniger）是一种在工业生产中占据关键地位的丝状真菌，在食品、医药、化工等众多领域有着广泛应用。在食品工业中，黑曲霉可用于食醋酿造、麸曲法白酒生产等；在医药领域，它能参与多种药物的合成过程；在化工领域，其产生的酶类和有机酸等物质具有重要价值。而在众多的应用中，黑曲霉发酵生产柠檬酸的工艺尤为突出。柠檬酸作为一种重要的有机酸，在食品、医药、化工等行业用途广泛。在食品行业，它被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。在医药行业，它是药物合成中的重要原料，也可作为多价螯合剂用于医药配方。在化工行业，可用于制造金属清洁剂、媒染剂等。全球柠檬酸市场需求持续增长，目前世界上柠檬酸年产量超过150万吨，其中99％以上是通过黑曲霉发酵生产，中国在柠檬酸生产的技术和产能方面均居世界领先地位。

α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）是一种在生物学、食品工业、制药工业等领域具有重要应用价值的酶类。在食品和饮料加工方面，它可以用于制作啤酒、发酵酱油和制浆等工艺中，能够加速淀粉类和糖类物质的水解，提高生产效率和产品质量。在医药领域，α-葡萄糖苷酶能够将多糖类物质水解成单糖，对于药物的合成、代谢以及疾病的治疗等方面具有重要的临床应用价值。在黑曲霉中，α-葡萄糖苷酶的合成主要受到柠檬酸代谢途径的调控。柠檬酸代谢途径是黑曲霉生长代谢的重要途径之一，它参与了许多重要代谢途径的调控，如能量代谢、物质合成与分解等。α-葡萄糖苷酶也会对柠檬酸代谢途径产生影响，其通过影响底物的利用和代谢产物的生成，进而影响黑曲霉的生长和柠檬酸的合成。

通过基因工程技术敲除黑曲霉中的α-葡萄糖苷酶基因，具有多方面的重要意义。从基础研究角度来看，能够深入探究α-葡萄糖苷酶在黑曲霉生长代谢中的调控机制和生理功能，进一步丰富对黑曲霉代谢网络的认识，为丝状真菌的基础研究提供新的理论依据。在工业应用方面，有望优化黑曲霉发酵生产柠檬酸的工艺。一方面，消除α-葡萄糖苷酶可能减少其与其他酶类在底物利用上的竞争，使黑曲霉能够更高效地利用碳源进行柠檬酸合成，提高柠檬酸的产量和纯度，降低生产成本；另一方面，有助于深入了解柠檬酸代谢途径的调控机制，为通过基因工程手段构建更优良的柠檬酸生产菌株奠定基础，推动柠檬酸产业的发展。

1.2国内外研究现状

在黑曲霉基因敲除技术方面，随着生物技术的不断发展，取得了一系列的进展。早期，丝状真菌基因敲除研究面临诸多困难，同源重组效率较低。但近年来，多种基因敲除技术不断涌现和完善。例如，CRISPR/Cas9系统作为新一代基因组编辑技术，为黑曲霉基因敲除带来了新的机遇。中国科学院天津工业生物技术研究所首次在黑曲霉中提出以核糖体5SrRNA基因为启动子介导sgRNA的表达，开发了一种基于5SrRNA的新型高效的CRISPR/Cas9系统，使Cas9对黑曲霉基因组定点切割效率可达100%，以此建立了黑曲霉高效基因组编辑工具包，实现了单位点、多位点的基因敲入以及长至48kb的大片段DNA敲除等基因组精准编辑。此外，还有Split-Marker技术等也应用于黑曲霉基因敲除，通过构建基因敲除表达盒，利用同源重组的原理实现基因的敲除。

在α-葡萄糖苷酶基因功能研究方面，国内外学者也进行了大量的工作。研究发现α-葡萄糖苷酶能从非还原末端水解低聚糖和多糖的α-1,4-葡萄糖苷键，也能作用于淀粉的α-1,6-糖苷键，在高葡萄糖苷受体环境中还可催化转糖苷反应。不同来源的α-葡萄糖苷酶其底物特异性、酶学性质等存在差异。黑曲霉来源的α-葡萄糖苷酶具有较高的转糖基化活性，且耐酸性强，在生产功能性低聚异麦芽糖等方面有应用，但也存在热稳定性差、底物特异性差等问题。有研究通过克隆不同生物来源的α-葡萄糖苷酶基因，并对其进行分子改造和异源表达等，以克服其在工业化应用中的不足。在黑曲霉发酵生产柠檬酸过程中，α-葡萄糖苷酶和糖化酶相互协作、相互影响，α-葡萄糖苷酶可以加速淀粉酶的降解，为糖化酶提供更多底物，同时二者对底物浓度和种类的选择也会影响柠檬酸的合成。

然而，目前对于产柠檬酸黑曲霉中α-葡萄糖苷酶基因敲除的研究还相对较少，尤其是系统研究α-葡萄糖苷酶基因敲除对黑曲霉生长代谢、柠檬酸合成及相关代谢途径影响的报道有限。已有的研究在基因敲除效率、敲除菌株的性能优化以及对复杂代谢网络影响的解析等方面仍存在不足，有待进一步深入探