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小麦、大麦K?电压门控通道蛋白β亚基基因分子克隆及序列分析

摘要

本研究旨在克隆小麦和大麦的K?电压门控通道蛋白β亚基基因，并进行序列分析。以普通小麦良麦4号和以色列大麦Shade-soil,Israel-36-01的cDNA为模板，通过PCR和分子克隆技术，成功分离出小麦和大麦的电压门控钾通道β亚基基因，分别命名为KTB和KHB。序列分析表明，KTB和KHB与已知的水稻电压门控钾通道β亚基基因有较高同源性，但属于新的基因类型。本研究为进一步探讨麦类作物钾离子吸收转运机制及提高钾肥利用效率奠定了基础。

关键词

小麦；大麦；K?电压门控通道蛋白β亚基基因；分子克隆；序列分析

一、引言

钾是植物生长必需的大量元素之一，在植物的诸多生理过程中发挥着关键作用，如酶的活化、光合作用、蛋白质合成、气孔运动以及维持细胞的膨压和离子平衡等。充足的钾供应对于提高作物产量和改善品质至关重要。然而，土壤中可被植物直接吸收利用的钾含量有限，且钾肥的过度使用不仅增加生产成本，还可能对环境造成负面影响。因此，深入了解植物对钾离子的吸收转运机制，提高植物自身对钾肥的利用效率，具有重要的理论和实践意义。

植物对钾离子的吸收主要通过钾离子通道和转运体来实现。电压门控钾通道是植物钾离子吸收转运体系的重要组成部分，其由α亚基和β亚基等组成。β亚基虽不直接参与钾离子的通透，但对α亚基的功能调节起着不可或缺的作用，二者协同影响钾通道的活性、电压依赖性及离子选择性等特性。目前，已在多种植物中对钾离子通道进行了研究，但关于小麦和大麦中K?电压门控通道蛋白β亚基基因的相关报道相对较少，其在钾吸收转运过程中的具体功能和调控机制尚不明确。本研究通过对小麦和大麦K?电压门控通道蛋白β亚基基因的克隆及序列分析，旨在为揭示麦类作物钾离子吸收转运的分子机制提供基础数据，为培育高效利用钾肥的麦类作物新品种提供理论依据。

二、材料与方法

2.1实验材料

选用普通小麦良麦4号（Triticumaectricum）和以色列大麦Shade-soil,Israel-36-01作为实验材料。将小麦和大麦种子经表面消毒后，播种于含有LK+MS培养液的培养皿中，于适宜条件下培养。培养液中以硝酸氨和磷酸二氢氨代替硝酸钾和磷酸二氢钾，并补加一定量的硝酸钾和氯化钠，使钾离子终浓度为100μM，钠离子终浓度为150mM，以此模拟低钾胁迫环境，诱导钾离子通道相关基因的表达。

2.2主要试剂与仪器

RNA提取试剂、反转录试剂盒、PCR相关试剂、限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自知名生物公司。PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机等仪器设备为本实验室常规配备。

2.3总RNA提取与cDNA合成

采用RNA提取试剂，按照说明书操作步骤，分别提取小麦和大麦幼苗根部组织的总RNA。利用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性。以提取的总RNA为模板，使用反转录试剂盒合成cDNA第一链，反应体系及条件参照试剂盒说明书进行设置。

2.4引物设计与合成

根据NCBI数据库中已知的钾通道β亚基编码基因保守片段，利用引物设计软件设计特异性引物。引物序列为：上游引物5-[具体序列]-3，下游引物5-[具体序列]-3。引物由专业生物公司合成，并经PAGE纯化。

2.5PCR扩增与产物回收

以合成的cDNA为模板，进行PCR扩增反应。反应体系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶等。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，[退火温度]℃退火30s，72℃延伸[延伸时间]，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，在130V恒定电压下电泳30分钟，使用凝胶成像系统观察并拍照，切取目的条带，利用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化。

2.6分子克隆

将回收的PCR产物与克隆载体（如pMD18-T载体）在T4DNA连接酶的作用下进行连接反应，连接体系及条件参照载体说明书。连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞（如DH5α）中，将转化后的细胞均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。

2.7阳性克隆筛选与鉴定

随机挑取平板上的单菌落，接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。提取菌液中的质粒，进行PCR鉴定和限制性内切酶酶切鉴定。将鉴定为阳性的克隆送至上海英骏公司进行测序。

2.8序列分析

利用NCBI网站中的blast