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紫外可见分光光度计使用方法

一、仪器结构与工作原理概述

紫外可见分光光度计是基于朗伯-比尔定律（Lambert-BeerLaw）设计的分析仪器，核心原理是通过测量物质对不同波长紫外光（190-400nm）和可见光（400-760nm）的吸收程度，实现对物质浓度、纯度或结构的定量/定性分析。其基本结构可分为五大核心模块：

光源系统

紫外光源：通常为氘灯（DeuteriumLamp），能发射190-400nm的连续紫外光，发光强度稳定，寿命约500-2000小时。

可见光源：通常为钨灯或卤钨灯，发射350-2500nm的连续可见光，覆盖400-760nm的可见分析范围。

仪器会根据设定波长自动切换光源，确保在不同波段都有足够的光强。

单色器

核心作用是将光源发出的复合光分解为单色光（单一波长的光），主要组件包括入射狭缝、准直镜、色散元件（如棱镜或光栅）和出射狭缝。其中，光栅因色散均匀、波长范围宽，是现代仪器的主流选择。

样品室

用于放置样品池（比色皿），常见规格有10mm、20mm、50mm光程，材质分为石英（适用于紫外-可见光区）和玻璃（仅适用于可见光区）。部分高端仪器配备自动进样器，可实现多样品连续检测。

检测器

将透过样品的光信号转换为电信号，常用类型包括：

光电倍增管（PMT）：灵敏度高、响应速度快，适用于低光强检测，但动态范围较窄。

光电二极管阵列（PDA）：可同时检测全波长范围的光信号，无需移动单色器，实现快速扫描（如1秒内完成190-900nm扫描），是现代仪器的发展趋势。

数据处理系统

由放大器、A/D转换器和计算机组成，可将电信号转换为吸光度（A）或透光率（T），并进行数据存储、曲线拟合、峰面积计算等分析。

二、实验前准备工作

实验前的充分准备是确保数据准确性的关键，需重点关注以下环节：

1.仪器检查与预热

外观检查：确认仪器外壳无破损、电源线连接牢固，样品室门开关正常。

预热要求：大部分仪器需预热15-30分钟（尤其是氘灯，需稳定发光强度），具体时间参照仪器说明书。预热期间避免频繁开关光源，以免缩短灯的寿命。

2.样品与试剂准备

样品处理：根据样品性质选择合适的前处理方法（如过滤、离心、萃取），确保样品澄清无浑浊（浑浊会导致光散射，干扰吸光度测量）。

溶剂选择：需满足三个条件：①与样品互溶；②在检测波长下无吸收（或吸收极低）；③不与样品发生化学反应。常用溶剂包括蒸馏水、乙醇、甲醇、己烷等。

浓度估算：根据朗伯-比尔定律，吸光度（A）的最佳范围为0.2-0.8（此时仪器误差最小）。若样品浓度过高，需进行稀释（如用移液管准确移取1mL样品至10mL容量瓶，加溶剂定容，稀释倍数为10）。

3.比色皿选择与清洗

材质匹配：检测波长≤350nm时，必须使用石英比色皿（玻璃对紫外光有强烈吸收）；波长350nm时，可使用玻璃或石英比色皿。

清洗步骤：

先用自来水冲洗3-5次，去除残留样品；

再用蒸馏水冲洗2-3次，沥干水分（或用无水乙醇润洗后晾干）；

避免用手触摸比色皿的光学面（手指印会导致光吸收），如需拿取，应捏住侧面磨砂部分。

配对检查：若使用多只比色皿，需进行配对性测试（在同一波长下，用同一溶剂装满所有比色皿，测量吸光度，差异应≤0.002A），否则需标记区分或更换。

三、标准操作流程（SOP）

以定量分析（如测定溶液中某物质的浓度）为例，详细操作步骤如下：

1.开机与参数设置

打开仪器电源，启动操作软件（如WPSOffice搭配的分光光度计控制插件，或仪器自带软件）。

设置检测参数：

波长选择：根据样品的最大吸收波长（λmax）设定，如测定铁离子（Fe3+）与邻菲啰啉的络合物时，λmax为510nm。若未知λmax，需先进行波长扫描（从190nm到800nm，找到吸光度最大的波长）。

测量模式：选择“吸光度（A）”或“透光率（T）”，定量分析通常使用吸光度模式（因A与浓度呈线性关系）。

扫描速度：快速扫描适用于定性分析，慢速扫描适用于定量分析（提高数据准确性）。

2.空白校正（基线校正）

空白校正是消除溶剂、比色皿、环境光等背景干扰的关键步骤，操作如下：

将装有空白溶液（仅含溶剂，不含样品）的比色皿放入样品室的“空白位”（通常为第一个位置）。

点击软件中的“空白校正”或“调零”按钮，仪器会自动将空白溶液的吸光度设为0（透光率设为100%）。

若进行全波长扫描，需先扫描空白溶液的基线，再用样品光谱减去基线，得到真实的样品吸收光谱。

3.样品测量

将处理好的样品溶液缓慢倒入比色皿（约占比色皿容积的4/5，避免产生气泡），用擦镜纸轻轻擦拭光学面（去除指纹或液滴）。

将比色皿放入样品室，确保光学面对准光路（部分比色皿侧面有箭头标记，需与光路方向一致），关闭样品室门。

点击“测量”按钮，仪器自动显示样品的吸光