甘蔗乙烯受体基因SoERS1表达、转化及启动子序列的研究.docxVIP

甘蔗乙烯受体基因SoERS1表达、转化及启动子序列的研究

摘要

在甘蔗的生长与发育进程中，生长素与乙烯作为两类关键的植物激素，对甘蔗的生长态势以及最终产量有着显著影响。乙烯主要通过调控乙烯受体基因的表达来发挥其生理作用。故而，深入探究甘蔗中乙烯受体基因的表达模式以及调控机制，对于解决甘蔗生长过程中面临的问题、提升甘蔗产量具备重要意义。本研究成功克隆了甘蔗乙烯受体基因SoERS1的cDNA序列，并借助数据库检索与生物信息学手段，详细剖析了SoERS1的启动子序列，精准预测了其中含有的调控元件。通过构建SoERS1启动子-报告基因表达载体，并运用农杆菌介导法将其成功转化至甘蔗之中。利用实时荧光定量PCR以及Westernblot等技术手段，对SoERS1在甘蔗不同发育阶段以及不同组织部位的表达状况展开了检测。同时，通过甘蔗转录组分析以及酵母双杂交等实验方法，初步揭示了SoERS1调控甘蔗乙烯响应的分子机制。本研究成果为深入理解甘蔗乙烯信号转导通路提供了关键数据，有望为甘蔗的遗传改良以及高效栽培提供坚实的理论支撑。

关键词

甘蔗；乙烯受体基因SoERS1；基因表达；基因转化；启动子序列

一、引言

甘蔗（SaccharumofficinarumL.）作为全球范围内最为重要的糖料作物，同时也是一种极具潜力的能源作物，在农业经济与生物能源领域占据着举足轻重的地位。其生长发育进程受到多种植物激素的精细调控，而乙烯便是其中一种至关重要的激素。乙烯参与了甘蔗生长发育的诸多环节，涵盖种子萌发、植株生长、开花诱导、果实成熟以及应对生物与非生物胁迫等过程。乙烯信号转导途径起始于乙烯与乙烯受体的特异性结合，在拟南芥中，已鉴定出5种乙烯受体，分别为ETR1（Ethyleneresponse1）、ETR2、ERS1（Ethyleneresponsesensor1）、ERS2和EIN4（Ethyleneinsensitive4）。其中，ERS1属于组氨酸激酶家族成员，在乙烯信号感知与传递过程中发挥着关键作用。在甘蔗中，深入研究乙烯受体基因SoERS1，对于全面解析乙烯调控甘蔗生长发育的分子机制，进而通过基因工程手段实现甘蔗品种的遗传改良，提升甘蔗产量与品质具有深远意义。

二、材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

选用甘蔗品种ROC22作为实验材料，种植于华南农业大学农学院实验基地。在甘蔗生长的不同发育阶段，分别采集根、茎、叶等组织样本，迅速置于液氮中冷冻，并保存于-80℃冰箱备用。

2.1.2菌株与载体

大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α和农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）EHA105为本实验室保存菌株。pMD18-TSimpleVector购自TaKaRa公司，pBI121植物表达载体由本实验室保存。

2.1.3主要试剂

RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶等均购自TaKaRa公司。DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2.2实验方法

2.2.1甘蔗总RNA的提取及cDNA的合成

采用RNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取甘蔗不同组织的总RNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，利用核酸蛋白测定仪测定RNA的浓度与纯度。取1μg总RNA，使用反转录试剂盒将其反转录为cDNA，反应体系及条件参照试剂盒说明书进行，得到的cDNA保存于-20℃备用。

2.2.2甘蔗乙烯受体基因SoERS1cDNA序列的克隆

依据NCBI数据库中已公布的甘蔗SoERS1基因的mRNA序列（登录号：XM_024038254.1），利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。上游引物P1：5-ATGGTGGTGGTGGTGGTG-3，下游引物P2：5-TCACTTGGTGGTGGTGGT-3。以反转录得到的甘蔗cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系（25μL）：10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，cDNA模板1μL，ddH?O15.3μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA凝胶回收试剂盒回收目的