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pcr技术实验指南

PCR（聚合酶链式反应）技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，能在短时间内将微量的DNA大幅扩增。以下是详细的PCR技术实验指南：

实验准备

试剂准备

1.DNA模板：从生物样本中提取的含有目标DNA片段的样本。可以使用多种方法从细胞、组织或其他生物材料中提取DNA，如酚氯仿抽提法、硅胶柱纯化法等。提取后的DNA应进行质量和浓度检测，一般要求A260/A280比值在1.82.0之间，以确保DNA的纯度适合PCR反应。

2.引物：引物是与目标DNA片段两端互补的短单链DNA序列，引导DNA聚合酶在模板上进行DNA合成。引物设计需遵循一定原则，如长度一般在1825个碱基之间，GC含量在40%60%左右，避免引物内部形成二级结构和引物间互补配对等。引物合成后需进行溶解，一般用TE缓冲液或去离子水配制成适当浓度，通常为10μM。

3.dNTP混合物：包含四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），是DNA合成的原料。dNTP混合物一般配制成每种dNTP浓度为2.5mM的溶液，储存于20℃。使用时要避免反复冻融，以免影响dNTP的稳定性。

4.DNA聚合酶：常用的有TaqDNA聚合酶，它具有热稳定性，能在高温下保持活性。不同的DNA聚合酶具有不同的特性，如保真度、延伸速度等。TaqDNA聚合酶一般保存在20℃，使用时需在冰上操作，避免酶活性丧失。

5.PCR缓冲液：为PCR反应提供合适的离子环境和pH值。通常包含TrisHCl、KCl、MgCl?等成分。Mg2?浓度对PCR反应的影响较大，一般需要根据实验情况进行优化，常见的Mg2?浓度在1.52.5mM之间。

6.去离子水：用于配制反应体系和稀释试剂，要求无核酸酶污染，一般使用经过高压灭菌的去离子水。

仪器准备

1.PCR仪：用于精确控制PCR反应的温度和时间。使用前需检查仪器的温度准确性和稳定性，确保能按照设定的程序进行反应。

2.离心机：用于离心PCR管，使试剂充分混合并沉淀到管底。一般选择微量离心机，转速能达到1000014000rpm。

3.移液器：准确吸取和添加各种试剂。应定期校准移液器，确保吸取体积的准确性。常用的移液器量程有0.510μL、10100μL、1001000μL等。

4.紫外透射仪：用于检测PCR产物。在凝胶电泳后，将凝胶放在紫外透射仪上，通过观察DNA条带的位置和亮度来判断PCR反应的结果。使用紫外透射仪时要注意防护，避免紫外线对人体造成伤害。

5.凝胶成像系统：用于记录和分析PCR产物的凝胶电泳结果。可以拍摄凝胶图像，并进行条带分析、分子量测定等操作。

实验步骤

反应体系配制

在冰上进行反应体系的配制，以减少非特异性扩增。一般的25μLPCR反应体系如下：

|试剂|体积（μL）|终浓度|

||||

|10×PCR缓冲液|2.5|1×|

|2.5mMdNTP混合物|2|200μMeach|

|10μM上游引物|1|0.4μM|

|10μM下游引物|1|0.4μM|

|DNA模板|12|根据模板浓度调整|

|TaqDNA聚合酶（5U/μL）|0.25|0.05U/μL|

|去离子水|补足至25μL||

将上述试剂依次加入到无菌的PCR管中，使用移液器轻轻吹打混匀，然后短暂离心，使试剂沉淀到管底。

PCR反应程序设置

不同的PCR反应可能需要不同的反应程序，一般包括以下几个阶段：

1.预变性：将PCR管放入PCR仪中，设置温度为9495℃，时间为35分钟。这一步的目的是使DNA模板完全变性，双链DNA解开成单链。

2.变性：温度设置为9495℃，时间为3060秒。在这个阶段，DNA双链再次变性，为引物结合提供单链模板。

3.退火：根据引物的Tm值（解链温度）设置退火温度，一般比引物Tm值低35℃，时间为3060秒。在退火阶段，引物与单链DNA模板特异性结合。

4.延伸：温度设置为72℃，时间根据扩增片段的长度而定，一般每1000bp的片段延伸时间为1分钟。在延伸阶段，DNA聚合酶以引物为起点，在dNTP的存在下，沿着模板合成新的DNA链。

5.循环次数：变性、退火和延伸三个步骤为一个循环，一般进行2535个循环。循环次数过多可能会导致非特异性扩增增加。

6.最终延伸：循环结束后，设置温度为72℃，时间为510分钟。这一步的目的是使未完全延伸的DNA链充分延伸。

7.保存：最后将温度设置为4℃，使PCR产物暂时保存。

凝胶电泳检测

1.制备琼脂糖凝胶：根据扩增片段的大小选择合适