蜡梅病程相关蛋白基因 CpPR - 1 的克隆及功能初步分析.docxVIP

蜡梅病程相关蛋白基因CpPR-1的克隆及功能初步分析

摘要

本研究采用RT-PCR及RACE技术，从蜡梅中成功克隆出病程相关蛋白基因CpPR-1。生物信息学分析显示，该基因全长731bp，开放阅读框为561bp，编码186个氨基酸。氨基酸序列比对表明，其与其他物种的PR1基因具有一定保守性。接种炭疽病菌后的时间序列表达分析表明，在高抗品种中，CpPR-1的表达受侵染上调，接种96h后表达量最高；而在高感品种中无显著差异。推测CpPR-1可能参与蜡梅的病害防御过程。

关键词

蜡梅；病程相关蛋白基因；克隆；功能分析

一、引言

蜡梅（Chimonanthuspraecox(L.)Link）作为我国传统名花，具有极高的观赏价值。然而，在其生长过程中，常受到多种病原菌的侵害，严重影响其观赏品质和经济价值。病程相关蛋白（Pathogenesis-relatedproteins，PRs）是植物在受到病原菌侵染时诱导产生的一类蛋白质，在植物抗病反应中发挥着重要作用。PR1蛋白是病程相关蛋白家族中的重要成员，研究表明其在植物抵御病原菌入侵过程中具有关键作用。目前，关于蜡梅病程相关蛋白基因CpPR-1的研究尚未见报道。本研究旨在克隆蜡梅CpPR-1基因，并对其功能进行初步分析，为深入了解蜡梅的抗病分子机制奠定基础。

二、材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

选取生长健壮、无病虫害的蜡梅品种‘素心蜡梅’为实验材料，种植于西南大学校内实验基地。采集其叶片，迅速用液氮冷冻后，保存于-80℃冰箱备用。

2.1.2菌株与载体

大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司。

2.1.3主要试剂

RNAisoPlus总RNA提取试剂、PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）反转录试剂盒、TaKaRaTaq?DNA聚合酶、dNTPs、限制性内切酶、T4DNA连接酶等均购自宝生物工程（大连）有限公司。DNA凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.2实验方法

2.2.1总RNA的提取及cDNA第一链的合成

采用RNAisoPlus总RNA提取试剂提取蜡梅叶片总RNA，具体操作按照说明书进行。用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用Nanodrop2000超微量分光光度计测定RNA的浓度和纯度。取1μg总RNA，利用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）反转录试剂盒合成cDNA第一链，反应体系及条件参照试剂盒说明书。

2.2.2CpPR-1基因的克隆

根据已报道的其他植物PR1基因的保守序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。上游引物：5’-ATGGCTCCCGAGTCC-3’；下游引物：5’-TCACTTGTCCAGCCAT-3’。以合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系（25μL）：10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaKaRaTaq?DNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，cDNA模板1μL，ddH?O17.3μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。将回收的目的片段与pMD18-T载体连接，连接体系（10μL）：pMD18-TVector1μL，回收的PCR产物4μL，SolutionI5μL。16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素（Amp）、IPTG和X-Gal的LB固体培养基上，37℃培养12-16h。挑取白色菌落，进行PCR鉴定及测序分析。

2.2.3CpPR-1基因的生物信息学分析

利用NCBI网站的ORFFinder在线工具分析CpPR-1基因的开放阅读框。通过ProtParam在线软件预测其编码蛋白的理化性质，包括分子量、