EBER原位杂交检测技术专家共识（2025版）.pptxVIP

EBER原位杂交检测技术专家共识(2025版)精准检测，规范诊断新标准

目录第一章第二章第三章EBER检测技术概述EBER检测技术原理组织处理与标本要求

目录第四章第五章第六章EBER检测操作流程临床应用与诊断价值专家共识要点与展望

EBER检测技术概述1.

EBV感染与EBERs简介EBV的广泛致病性：EB病毒（Epstein-Barrvirus）是人类疱疹病毒4型，与鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌等多种恶性肿瘤密切相关，全球约90%成人携带该病毒，其潜伏感染可导致终身携带。EBERs的核心标志物作用：EBERs（EBV编码的小RNA）是EB病毒潜伏感染期高表达的RNA片段（EBER-1/EBER-2），不编码蛋白但可作为病毒活跃复制的分子标志，具有高度稳定性和特异性。EBERs检测的临床价值：通过检测EBERs可明确EBV感染状态（潜伏期或活跃期），为肿瘤分型、预后评估及靶向治疗提供关键依据。

检测技术的重要性EBV相关肿瘤（如鼻咽癌、淋巴瘤）的病理诊断需依赖EBERs检测，以区分EBV阳性与阴性亚型，指导个体化治疗方案的制定。精准诊断需求EBERs阳性结果与肿瘤侵袭性、免疫微环境特征（如PD-L1表达）显著相关，可预测患者对免疫治疗的响应及长期生存率。预后评估意义EBERs检测为EBV致病机制研究提供工具，推动新型抗病毒药物和免疫疗法的开发。科研与临床转化

技术标准化需求不同实验室采用的探针设计、杂交条件（如温度、时间）和信号检测方法存在差异，需统一操作流程以确保结果的可比性和重复性。针对样本类型（如福尔马林固定石蜡包埋组织）的预处理标准需规范，避免RNA降解导致假阴性结果。临床实践指导明确EBERs检测的适应症范围，包括疑似EBV相关肿瘤的初诊、复发监测及治疗疗效评估。提出结果解读的标准化框架，如阳性阈值定义（细胞核内明确信号）、与免疫组化（如LMP1检测）的联合应用策略。质量控制要求规定每批次检测需包含阳性和阴性对照样本，确保实验系统稳定性。建议采用自动化平台减少人为误差，并通过实验室间质评验证检测准确性。专家共识制定依据

EBER检测技术原理2.

核酸互补配对：利用标记的EBER探针与靶RNA通过碱基互补配对形成特异性杂交复合物，实现EB病毒RNA的定位检测。信号放大系统：采用生物素-链霉亲和素或多级酶标抗体系统对杂交信号进行级联放大，显著提高检测灵敏度至单拷贝水平。组织固定与通透性处理：通过优化甲醛固定时间和蛋白酶K消化强度，在保持组织形态完整性的同时确保探针充分渗透至细胞内。原位杂交基本原理

保守区段靶向针对EBER-1（167nt）和EBER-2（172nt）的保守茎环结构设计探针，避免与人类基因组非特异性结合，确保检测特异性98%。热力学优化通过调整探针GC含量（建议40-60%）和Tm值（65±5℃），确保在42℃杂交温度下能区分单碱基错配，降低假阳性风险。内对照设置探针组合需包含人类U6snRNA或β-actinmRNA作为内参，用于验证RNA保存质量和杂交体系有效性。双标记策略探针同时携带地高辛（DIG）和荧光素（FITC）标记，支持双重检测模式，适用于常规病理切片（DAB显色）和共聚焦显微镜分析（荧光信号）。特异性核酸探针设计

显色法定位采用DAB显色产生棕色沉淀物，通过普通光学显微镜观察，信号定位于细胞核（潜伏期）或核仁（活跃复制期），适用于常规病理诊断。荧光法量化使用CY3/CY5荧光标记探针，配合共聚焦显微镜进行信号强度分析，可半定量评估EBV病毒载量，用于疗效监测研究。自动化分析整合图像分析软件（如Image-ProPlus），基于显色面积和光密度值建立评分系统（0-3+），实现结果客观标准化。杂交信号可视化方法

组织处理与标本要求3.

样本固定指南组织离体后应在30分钟内用10%中性缓冲福尔马林固定，固定时间控制在6-48小时范围内，避免过度固定导致核酸降解。固定时间控制推荐使用pH7.2-7.4的10%中性缓冲福尔马林溶液，避免使用酸性固定液或含重金属的固定剂。固定液选择固定过程应在室温(15-25℃)下进行，禁止加热固定或冷冻固定，以保证EBERRNA的完整性。固定温度要求

脱水与包埋采用梯度乙醇脱水（70%-95%-100%），二甲苯透明，石蜡包埋温度控制在60-65℃，避免高温导致RNA降解。切片制备使用无RNA酶环境制备4-5μm厚切片，贴附于阳离子或硅烷化玻片上，60℃烘烤1小时以增强组织粘附性。组织固定要求使用10%中性缓冲福尔马林固定液，固定时间控制在6-48小时，确保组织充分固定但不过度固定。组织处理标准化流程

术前准备内镜取材规范：肠道EBV感染需系统性活检，溃疡边缘与正常黏膜对照取材，避免仅取坏死组织。快速固定要求：标本离体后30分钟内投入固定液，延迟固定会导致RNA