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瑞氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1和cbh2双敲除菌株构建研究

一、引言

1.1研究背景与意义

随着全球对可持续能源和绿色化学的关注度不断提高，纤维素作为地球上最丰富的可再生生物质资源之一，其有效利用成为了研究热点。瑞氏木霉（Trichodermareesei）是一种在纤维素酶生产领域具有重要地位的丝状真菌，因其能够高效分泌多种纤维素酶，在工业生产中被广泛应用。

纤维素酶是一组能够协同作用将纤维素降解为葡萄糖的酶系，主要包括内切葡聚糖酶（EG）、纤维二糖水解酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BG）。其中，纤维二糖水解酶基因cbh1和cbh2在纤维素降解过程中发挥着关键作用。cbh1基因编码的纤维二糖水解酶I（CBHI）能够从纤维素链的非还原端依次水解β-1,4-糖苷键，产生纤维二糖；cbh2基因编码的纤维二糖水解酶II（CBHII）则主要作用于纤维素链的还原端，同样水解β-1,4-糖苷键，生成纤维二糖或纤维三糖。这两种酶在瑞氏木霉降解纤维素的过程中相互协作，对纤维素的高效降解起着不可或缺的作用。

深入了解cbh1和cbh2基因的功能及其在纤维素降解中的作用机制，对于优化纤维素酶的生产、提高纤维素的降解效率具有重要意义。构建瑞氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1和cbh2双敲除菌株，能够通过对比野生型菌株和双敲除菌株在纤维素降解能力、生长特性以及酶表达谱等方面的差异，为深入探究纤维素酶的作用机制提供有力的实验材料。此外，通过对双敲除菌株的研究，还可能发现新的纤维素降解途径或调控机制，为纤维素酶的基因工程改造提供新思路，从而进一步提升纤维素酶在生物能源、食品、饲料等领域的应用潜力。

1.2国内外研究现状

在瑞氏木霉基因敲除技术方面，国内外学者已开展了大量研究，并取得了显著进展。同源重组法作为一种经典的基因敲除方法，在瑞氏木霉基因功能研究中得到了广泛应用。通过构建包含与目标基因上下游同源序列以及筛选标记基因的敲除载体，利用同源重组的原理将目标基因替换为筛选标记基因，从而实现基因敲除。例如，有研究利用同源重组法成功敲除了瑞氏木霉中的某些纤维素酶基因，对其酶活和降解能力进行了深入分析。此外，转座子介导法也在瑞氏木霉基因敲除中有所应用，通过转座子随机插入基因组，实现对目标基因的破坏。随着基因编辑技术的飞速发展，锌指核酸酶（ZFNs）法和规律性间隔的成簇排列的短回文重复序列（CRISPR）/Cas9系统等新型基因编辑技术也逐渐应用于瑞氏木霉基因敲除研究中。这些技术具有更高的靶向性和效率，为瑞氏木霉基因功能研究提供了更为强大的工具。

在cbh1和cbh2基因功能研究方面，国内外学者也进行了大量探索。研究表明，cbh1基因在瑞氏木霉纤维素酶分泌中占主导地位，其表达量和活性对纤维素降解效率影响显著。敲除cbh1基因后，菌株对结晶纤维素的降解能力明显下降。cbh2基因虽然在纤维素酶分泌中所占比例相对较小，但其与cbh1基因存在协同作用，共同参与纤维素的水解过程。通过对cbh1和cbh2基因单独敲除菌株的研究，揭示了它们在纤维素降解中的不同作用方式和特点。然而，目前对于cbh1和cbh2基因同时缺失对瑞氏木霉纤维素降解机制和整体代谢的影响研究还相对较少，存在一定的研究空白。

综上所述，当前关于瑞氏木霉基因敲除技术和cbh1、cbh2基因功能的研究已取得了一定成果，但在深入探究cbh1和cbh2基因双敲除对瑞氏木霉纤维素降解机制及应用潜力方面仍有进一步研究的空间。本研究将以此为切入点，开展相关研究工作。

1.3研究目标与内容

本研究旨在构建瑞氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1和cbh2双敲除菌株，通过对双敲除菌株的特性分析，深入了解cbh1和cbh2基因在瑞氏木霉纤维素降解过程中的作用机制，为优化纤维素酶生产和开发新型纤维素降解菌株提供理论基础和实验依据。

具体研究内容包括：

敲除策略设计：对瑞氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1和cbh2的序列进行深入分析，结合基因敲除技术原理和瑞氏木霉的遗传特性，选择合适的敲除策略，如同源重组敲除策略。确定敲除元件，包括与cbh1和cbh2基因上下游同源的序列，以及筛选标记基因等，确保能够准确、高效地实现基因敲除。

菌株构建流程：依据设计的敲除策略，进行基因敲除载体的构建。利用分子生物学技术，将敲除元件和筛选标记基因连接到合适的载体上，构建出针对cbh1和cbh2基因的双敲除载体。通过电转化、PEG转化等方法将构建好的基因敲除载体导入瑞氏木霉受体细胞中，实现基因敲除载体在瑞氏木霉基因组中的整合。对转化后的菌株进行筛选，通过抗性筛选和PCR鉴定等方法，