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云芝与赤芝原生质体融合及其特性研究：探索药用真菌育种新路径

一、引言

1.1研究背景与意义

云芝（Coriolusversicolor）与赤芝（Ganodermalucidum）作为我国传统的名贵中药真菌，拥有极高的药用价值。云芝性甘、味淡，是极具药用价值的真菌之一，具备清热、解毒、消炎、抗癌以及保肝等功效。其主要活性成分云芝多糖，拥有出色的免疫调节功能，是优秀的免疫增强剂，能够增强免疫细胞功能和识别能力，对肝脏也有良好的保护作用，可显著降低血清转氨酶，对肝组织病变和肝坏死有明显的修复作用。赤芝在灵芝范畴中性甘味平，归心经、肺经、肝经和肾经，有着补气、安神、止咳、平喘的作用，常用于治疗眩晕、不眠、气虚、心悸、气短以及虚劳导致的咳喘等症状。赤芝中含有的多种成分，对中枢系统有作用，可镇痛，还能强心，用于治疗心血管疾病，具备抗凝、抗血小板聚集、抗血栓的作用，同时对代谢及内分泌系统产生影响，还有护肝、抗氧化、延缓衰老、抗炎等功效。然而，由于它们的生长环境特殊、生长周期较长等因素，其产量难以满足市场需求，价格也相对昂贵。

原生质体融合技术作为真菌遗传育种中的重要手段，极大地拓展了物种之间的杂交范围，让远缘杂交得以实现，扩大了蕈菌的基因库容。该技术通过去除细胞壁的障碍，使得种内、种间甚至属间杂交成为可能，能够打破物种间的遗传屏障，在分子水平上对不同物种的基因进行操作，从而创造出具有多种优良性状的新菌株。将云芝与赤芝的原生质体进行融合，有望培育出兼具两者优点的新型药用真菌。这种新型真菌不仅可能综合云芝和赤芝的药用功效，提高其药用价值，还可能改善其生长特性，如加快生长速度、增强抗逆性等，从而提高产量，降低生产成本，满足市场对药用真菌日益增长的需求，对于推动药用真菌产业的发展具有重要意义。

1.2国内外研究现状

国内外对于云芝与赤芝原生质体融合的研究已取得了一定成果。在原生质体制备方面，诸多研究对影响云芝和赤芝原生质体制备与再生的因素进行了探索。有研究运用正交试验，确定了以培养5d的云芝菌丝体，用2％的溶壁酶，以0.6mol／L的MgS04为渗稳剂，33℃下酶解3h作为云芝原生质体的制备条件；以培养7d的赤芝菌丝体，用1.5％的溶壁酶，以0.6mol／L的MgS04为渗稳剂，30℃下酶解2h作为赤芝原生质体的制备条件，可获得数量最多、活性最高的原生质体。在再生培养基的筛选上，确定了采用麦芽糖10g、葡萄糖4g、酵母粉4g、琼脂5.5g，以0.6M蔗糖作渗稳剂的再生培养基，其再生效果最佳。

在原生质体融合及融合子筛选鉴定方面，有研究利用云芝和赤芝对潮霉素天然抗药性的差异，结合原生质体灭活作为融合子筛选的依据，并在PEG诱导下使两蕈菌原生质体融合，得到了生长良好的融合株。通过对融合株与两亲本进行菌丝生长速度、液体生物量积累、菌丝显微特征、菌落表型、DNA含量的比较以及三者的拮抗试验，初步确定融合株为云芝与赤芝原生质体融合的产物。

然而，现有研究仍存在一些待解决的问题。一方面，原生质体融合率较低，如某研究中融合率仅为1.76x10??，如何提高融合率，是亟待解决的关键问题。另一方面，对于融合子的遗传稳定性和药用活性的深入研究还相对缺乏。虽然已初步鉴定出融合子，但融合子在传代过程中的遗传稳定性如何，其药用活性是否真正综合了云芝和赤芝的优势，以及相关的作用机制等，都需要进一步深入探究。

1.3研究目标与内容

本研究旨在通过原生质体融合技术，将云芝与赤芝的原生质体进行融合，筛选和鉴定出兼具两者优良特性的融合子，为培育新型药用真菌提供理论和技术支持。具体研究内容如下：

云芝与赤芝原生质体制备条件的优化：系统研究菌龄、酶的种类及浓度、稳渗剂的种类、酶解温度和时间等因素对云芝和赤芝原生质体制备的影响，运用正交试验等方法，确定最佳的制备条件，以获得数量多、活性高的原生质体。

云芝与赤芝原生质体融合条件的探究：探索不同融合剂种类及浓度、融合时间、融合温度等因素对原生质体融合的影响，确定最佳的融合条件，提高融合率，获得更多的融合子。

融合子的筛选与鉴定：利用云芝和赤芝对潮霉素天然抗药性的差异，结合原生质体灭活等方法，筛选出融合子。通过对融合子的菌丝生长速度、液体生物量积累、菌丝显微特征、菌落表型、DNA含量等方面的分析，以及与两亲本的拮抗试验，鉴定融合子的真实性和遗传特性。

融合子药用活性的初步分析：对筛选鉴定出的融合子进行药用活性的初步研究，检测其多糖、三萜等主要药用成分的含量，并与云芝和赤芝亲本进行比较，分析融合子是否具有更优良的药用活性。

1.4研究方法与技术路线

本研究采用的实验方法主要包括：文献研究法，全面收集和分析国内外关于云芝与赤芝原生质体融合及相关领域的研究文献，为研究提供理论