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流式细胞术测定蠕形螨基因组大小的实验方案

流式细胞术凭借其快速、准确且能对大量细胞进行分析的特点，成为测定基因组大小的有效手段。以下是运用该技术测定蠕形螨基因组大小的详细方案。

一、实验材料准备

（一）蠕形螨样本

样本采集：选择合适的采集部位，若为寄生在人体面部的蠕形螨，可在清晨未洗脸前，用无菌棉签蘸取少量生理盐水，在鼻翼、额部等蠕形螨易寄生部位轻轻擦拭，将棉签放入含有生理盐水的离心管中。对于其他宿主的蠕形螨，根据其寄生部位采取相应的无菌采集方法。

样本筛选：在显微镜下观察离心管中的样本，挑选活力较好、形态完整的蠕形螨个体，用移液枪将其转移至新的离心管中，并用生理盐水清洗2-3次，以去除杂质。

（二）内参标准品

选择已知基因组大小的生物细胞作为内参标准品，常用的有鸡红细胞（基因组大小约为2.5pg）、人外周血淋巴细胞（基因组大小约为3.5pg）等。内参标准品需保证细胞活力良好，且与蠕形螨样本在染色过程中具有相似的行为。

（三）试剂与耗材

试剂：PBS缓冲液（pH7.2-7.4）、细胞核提取液（可自行配制或购买商品化试剂）、荧光染料（如PI，碘化丙啶，需避光保存）、RNaseA（用于去除RNA干扰）、固定剂（如70%乙醇）。

耗材：离心管（1.5mL、15mL）、移液枪（10μL、100μL、1000μL）及配套吸头、显微镜载玻片与盖玻片、流式细胞仪专用样品管、过滤器（300目，用于过滤细胞碎片）。

（四）仪器设备

流式细胞仪（如BDFACSCanto?II）、显微镜、离心机、恒温水浴锅、超净工作台、涡旋振荡器。

二、样本处理

（一）蠕形螨细胞核提取

向含有筛选好的蠕形螨样本的离心管中加入适量的细胞核提取液，用涡旋振荡器轻轻涡旋1-2分钟，使蠕形螨体壁破碎。

将离心管置于冰上孵育10-15分钟，促进细胞核释放。

用300目过滤器过滤样本，去除未破碎的虫体残骸和杂质，收集滤液于新的离心管中。

向滤液中加入RNaseA（终浓度为50-100μg/mL），37℃恒温水浴锅中孵育30分钟，以去除RNA。

（二）内参标准品处理

取适量内参标准品细胞，用PBS缓冲液洗涤2次，1000r/min离心5分钟，弃去上清液。加入与蠕形螨样本处理相同的细胞核提取液，按照上述蠕形螨细胞核提取的步骤进行处理，获得内参标准品的细胞核悬液。

（三）荧光染色

将处理好的蠕形螨细胞核悬液与内参标准品细胞核悬液按适当比例混合（通常1:1），加入荧光染料PI（终浓度为50μg/mL），轻轻混匀，避光冰上孵育20-30分钟。

三、流式细胞仪操作

（一）仪器准备

打开流式细胞仪，进行预热（通常30分钟左右），按照仪器操作规程进行校准，确保仪器性能稳定。

（二）样本检测

将染色后的样本轻轻混匀，避免产生气泡，装入流式细胞仪专用样品管中。

设置流式细胞仪的检测参数，激发波长选择488nm，检测PI的发射波长为610nm左右。

开始检测样本，每个样本至少收集10000个细胞核的荧光信号数据。在检测过程中，注意观察散点图和直方图，确保细胞核的信号稳定。

四、数据分析

（一）数据获取与整理

使用流式细胞仪配套的分析软件（如BDFACSDiva?Software）获取样本的荧光强度数据，将数据导出并整理。

（二）基因组大小计算

根据内参标准品已知的基因组大小和其荧光强度平均值，以及蠕形螨样本的荧光强度平均值，按照以下公式计算蠕形螨的基因组大小：

蠕形螨基因组大小（pg）=（蠕形螨样本荧光强度平均值/内参标准品荧光强度平均值）×内参标准品基因组大小（pg）

注：1pg基因组DNA约等于978Mb，可根据需要将结果转换为Mb。

五、注意事项

样本采集过程中需保持无菌操作，避免污染。

细胞核提取时，涡旋强度不宜过大，以免破坏细胞核；孵育时间需适当控制，确保细胞核充分释放。

荧光染色时，需严格控制染料浓度和孵育时间，避光操作，避免荧光淬灭。

流式细胞仪检测前，需确保样本过滤充分，避免杂质堵塞仪器管道。

每个样本至少进行3次生物学重复实验，以保证结果的可靠性。

实验过程中需做好安全防护，避免接触有毒试剂。