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第四章微生物细胞的破碎;为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：;;;细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；

酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；

由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。

不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，由难到易的大致排列顺序为：植物细胞＞真菌（如酵母菌）＞革兰氏阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞。;进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。;高速珠磨机;实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、Braun匀浆器；

中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；

在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。;胶体磨;采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国Microfluidics公司均有产品出售）。;高压匀浆器;大、中、小型高压匀浆器;在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。

一般说来，酵母菌较细菌难破碎，处于静止状态的细胞较处于快速生长状态的细胞难破碎，在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培养基上培养的细胞较难破碎。;破碎的动力学方程为：ln[1／（l－R）]＝KNPα

其中R——破碎率；

K——与温度有关的速度常数；

P一操作压力；

N一悬浮液通过匀浆器阀的次数。

α——与微生物种类有关的常数；

破碎酵母菌,α值可取2.2。可见，影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。

;利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。

一般认为超声波破碎的??理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。

;;4.酶溶法（EnzymaticLysis）;如：对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。;诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。

影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。

缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。;某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。;如TritonX-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。

其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可使细胞破碎。;处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。;能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。

甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。;不同细胞可采用的化学渗透处理方式;通用性差；

时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；

有些化学试剂有毒。;将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。

此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。;将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。

仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。;将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。

由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破