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中医药干预脉络膜新生血管的实验研究

一、研究背景

脉络膜新生血管（ChoroidalNeovascularization，CNV）是一种严重危害视力的眼部疾病，常见于年龄相关性黄斑变性、病理性近视等眼底疾病。其主要病理特征为脉络膜毛细血管异常增生并突破Bruch膜，侵入视网膜下腔，引发出血、渗出、瘢痕形成等一系列病理改变，最终导致中心视力不可逆性下降甚至丧失。

目前，临床上治疗CNV的主要方法包括抗血管内皮生长因子（VEGF）药物玻璃体内注射、光动力疗法、激光光凝术等。抗VEGF药物虽能在短期内有效抑制CNV生长、改善视力，但需要反复注射，不仅增加了患者的经济负担和痛苦，还可能引发眼内感染、视网膜脱离等严重并发症。光动力疗法和激光光凝术则存在对周围正常组织损伤较大、易复发等局限性。因此，寻找一种安全、有效、低复发率的治疗方法已成为眼科领域研究的热点和难点。

中医药在眼部疾病治疗方面具有悠久的历史和独特的理论体系，其整体观念和辨证论治的思想为CNV的治疗提供了新的思路。近年来，随着中医药现代化研究的不断深入，越来越多的研究表明，中医药在抑制血管新生、改善微循环、减轻炎症反应等方面具有显著优势。本研究旨在通过实验研究，探讨中医药干预脉络膜新生血管的作用机制和疗效，为CNV的临床治疗提供新的实验依据和治疗策略。

二、研究目的

建立稳定、可靠的脉络膜新生血管动物模型，为后续实验研究提供良好的实验载体。

观察不同剂量的中医药（如中药复方、单体成分等）对脉络膜新生血管生长的干预效果，筛选出最佳用药剂量。

从分子生物学、细胞生物学等层面探讨中医药干预脉络膜新生血管的作用机制，明确其是否通过调控VEGF、色素上皮衍生因子（PEDF）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）等相关因子的表达，以及影响血管内皮细胞增殖、迁移、凋亡等过程来发挥作用。

评估中医药干预脉络膜新生血管的安全性，观察实验动物在用药过程中是否出现全身及眼部不良反应。

三、研究方法

（一）实验动物与分组

选取健康清洁级C57BL/6小鼠，雌雄各半，体重20-25g，周龄6-8周。将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、中医药低剂量组、中医药中剂量组、中医药高剂量组，每组15只。

（二）脉络膜新生血管动物模型的建立

采用氪激光光凝法建立小鼠脉络膜新生血管模型。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉后，滴入0.5%托吡卡胺滴眼液散瞳，在裂隙灯显微镜下，使用氪激光治疗仪（波长532nm，功率150mW，光斑直径50μm，曝光时间0.1s）对小鼠右眼视网膜后极部进行光凝，每眼光凝4个点，避免损伤视神经和大血管。正常对照组小鼠仅进行散瞳处理，不进行激光光凝。

（三）给药方法

模型建立成功后，中医药各剂量组小鼠分别按照10g/kg、20g/kg、40g/kg的剂量灌胃给予相应浓度的中医药制剂（如中药复方水煎液、中药单体溶液等），正常对照组和模型对照组小鼠灌胃给予等体积的生理盐水，每日1次，连续给药21天。

（四）检测指标与方法

眼底荧光血管造影（FFA）检查：分别于给药后7天、14天、21天，对各组小鼠进行FFA检查。小鼠腹腔注射1%荧光素钠（100mg/kg）后，立即在裂隙灯显微镜下观察并拍摄眼底荧光血管造影片，根据荧光渗漏情况判断CNV的形成及严重程度。采用Image-ProPlus6.0图像分析软件测量CNV渗漏面积，计算渗漏面积占光凝点总面积的百分比。

组织病理学检查：给药21天后，处死各组小鼠，取右眼眼球，置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，常规脱水、石蜡包埋，制作5μm厚的连续切片，进行HE染色。在光学显微镜下观察视网膜、脉络膜组织的病理形态学改变，计数CNV形成的数量，并测量CNV的最大厚度。

免疫组织化学检测：取上述石蜡切片，采用免疫组织化学SP法检测视网膜及脉络膜组织中VEGF、PEDF、HIF-1α蛋白的表达。具体步骤如下：脱蜡至水，3%H?O?室温孵育10min以阻断内源性过氧化物酶活性，抗原修复，封闭，加入一抗（VEGF兔抗小鼠多克隆抗体、PEDF兔抗小鼠多克隆抗体、HIF-1α兔抗小鼠多克隆抗体），4℃孵育过夜，加入二抗，室温孵育30min，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。在光学显微镜下观察阳性表达情况，采用Image-ProPlus6.0图像分析软件测量阳性表达区域的平均光密度值（IOD/Area），以反映蛋白的表达水平。

Westernblot检测：取各组小鼠右眼视网膜及脉络膜组织，提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白进行SDS-