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甜樱桃内参基验证与MADS-box基因的克隆及表达分析

一、甜樱桃内参基因验证

1.1内参基因的选择

在众多内参基因中，挑选了在多种生物实验中常用的基因，如GAPDH（编码糖酵解过程中的糖醛酸脱氢酶，在多种组织中稳定表达）、18SrRNA（RNA转录成蛋白质过程中的关键因素，表达稳定）、β-actin（编码肌动蛋白的一种谷氨酰胺激酶，在各种细胞中稳定表达）以及UBC（编码泛素通路的一种谷氨酰胺激酶，在细胞周期中可作为实用内参基因）。这些基因在维持细胞基本生理功能中起着重要作用，理论上应具有相对稳定的表达水平，适合作为甜樱桃内参基因的候选基因。

1.2内参基因稳定性评价

对上述候选内参基因，通过对甜樱桃不同组织或不同时期样本进行qRT-PCR实验来测定其表达水平。通常，在不同组织中表达量变化较小的基因更适合作为内参基因。为了更准确地评估基因的稳定性，计算了候选内参基因的变异系数（CV），CV值越小，代表基因稳定性越好。同时，运用统计学方法，借助geNorm、NormFinder等工具对这些内参基因的稳定性进行综合分析。这些工具能够从不同角度评估基因表达的稳定性，如geNorm可通过计算基因间的表达稳定性值（M值）来衡量，M值越小，基因稳定性越高；NormFinder则基于方差分析，评估基因在不同样本组间的表达稳定性，从而更全面地筛选出稳定表达的内参基因。

1.3内参基因的定量分析

进行qRT-PCR实验时，严格按照实验操作规程进行。以不同组织的RNA为模板，反转录合成cDNA。反应体系包含2.5μl10×PCRLABufferII、2.5μldNTPMixture（2.5mM）、1μlPrimerMix（10μM/μl）、0.25μlTaKaRaLATaq（5U/μl）、2μlcDNASolution（100ng/μl）以及18.75μlddH?O。反应条件为：94℃预变性5min；随后进行30个循环，每个循环包括94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min；最后72℃再延伸5min，4℃暂存。PCR产物通过凝胶电泳进行分离检测，根据条带的亮度和清晰度等判断基因的表达情况，进一步通过灰度分析等手段对基因表达量进行相对定量，为后续稳定性分析提供数据基础。

1.411个内参基因在8个樱桃品种叶片中表达的稳定性分析

选取了8个不同的甜樱桃品种，对11个内参基因在其叶片中的表达稳定性进行深入分析。利用之前提到的geNorm和NormFinder软件进行评估，结果表明在不同樱桃品种中，基因的稳定性存在差异。根据geNorm程序分析，候选参考基因rpl13和rpii在8个测试樱桃基因型中表现出相对较好的稳定性；而通过NormFinder分析，act基因的稳定性最佳。这说明不同的分析软件由于算法和侧重点不同，可能会得出略有差异的结果，但综合多个软件的分析结果能够更准确地筛选出在不同樱桃品种叶片中稳定表达的内参基因。

1.5内参基因验证

为了进一步验证筛选出的内参基因的可靠性，分别以稳定性较好的内参基因（如EF-1a2、RSP3及EF-1a2+RSP3等组合）作为参照，检测不同发育时期花芽中生长素运输载体AUX1基因及生长素响应因子ARF基因的表达模式。实验结果显示，在不同内参基因标定下，AUX1基因和ARF基因的表达模式相同，这有力地证明了所筛选出的EF-1a2、RSP3及EF-1a2+RSP3等内参基因在甜樱桃花芽不同发育时期具有良好的稳定性和适用性，可用于甜樱桃相关基因表达分析的内参基因。

二、甜樱桃MADS-box基因的克隆与表达分析

2.1PaMADS基因在各花器官中的表达

以甜樱桃品种‘拉宾斯’为材料，采用RT-PCR结合RACE方法克隆胚囊发育相关的MADS-boxSEP类基因cDNA全长。通过对不同花器官（如萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊等）进行RNA提取，反转录为cDNA后进行PCR扩增。结果克隆得到一个基因全长999bp，命名为PaMADS4（GenBank登录号：JQ686726），该基因包含一个735bp的开放阅读框，编码244个氨基酸。通过半定量PCR法对其在各花器官中的表达进行特异性分析，发现PaMADS4在四轮花器官中均有表达，说明该基因可能在花器官的发育和功能维持中具有重要作用。

2.2PaMADS基因在各花器官不同发育时期的表达

进一步对不同花器官在不同发育时期（如花芽分化前期、中期、后期，开花期