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EMT过程中microRNAs与靶基因CDH1相互作用实验研究

一、引言

上皮-间质转化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）是指上皮细胞在特定的生理和病理条件下向间质细胞转化的现象。在这一过程中，上皮细胞逐渐失去其极性和细胞间连接，获得间质细胞的特性，如迁移和侵袭能力增强。EMT在胚胎发育、组织修复以及肿瘤转移等过程中发挥着至关重要的作用。

MicroRNAs（miRNAs）是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，它们通过与靶基因mRNA的互补配对结合，在转录后水平对基因表达进行调控。一个miRNA可以调控多个靶基因，参与细胞的增殖、分化、凋亡、迁移等多种生物学过程。研究表明，miRNAs在EMT过程中也扮演着重要角色，通过调控相关靶基因的表达，影响EMT的发生和发展。

CDH1基因编码上皮钙黏蛋白（E-cadherin），是维持上皮细胞极性和细胞间黏附的关键分子。在EMT过程中，E-cadherin的表达通常会显著下调，导致细胞间黏附力减弱，细胞易于发生迁移和侵袭。已有研究发现，多种miRNAs可以通过直接或间接作用于CDH1基因，调控其表达，进而影响EMT过程。深入研究EMT过程中miRNAs与靶基因CDH1的相互作用机制，对于理解EMT的调控网络以及相关疾病的发生发展具有重要意义。

二、实验目的

本实验旨在探究EMT过程中与靶基因CDH1相互作用的miRNAs，并明确它们之间的作用机制，为进一步揭示EMT的分子调控机制提供实验依据。

三、实验材料与方法

（一）实验材料

细胞系：人正常上皮细胞系[具体名称]和诱导发生EMT的上皮细胞系[诱导方法及诱导后细胞系名称]。

主要试剂：RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒、miRNA模拟物（mimics）、miRNA抑制剂（inhibitors）、脂质体转染试剂、蛋白质提取试剂盒、Westernblot相关试剂等。

仪器设备：PCR仪、实时荧光定量PCR仪、荧光显微镜、酶标仪、离心机、电泳仪、转膜仪等。

（二）实验方法

**CDH13UTR区上miRNA结合位点的预测

利用生物信息学软件，如TargetScan、miRanda等，对CDH1基因的3非翻译区（3UTR）进行分析，预测可能与之结合的miRNAs及其结合位点。

**细胞培养与转染

将人正常上皮细胞系和诱导发生EMT的上皮细胞系分别培养于含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素-链霉素）的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO?的培养箱中培养。当细胞生长至对数期时，按照脂质体转染试剂说明书进行操作，将miRNA模拟物、miRNA抑制剂或相应的阴性对照分别转染至细胞中。

**RNA提取与反转录

转染后[设定时间]，使用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，通过紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度。取适量的RNA，按照反转录试剂盒说明书进行反转录反应，合成cDNA，用于后续的实时荧光定量PCR分析。

**实时荧光定量PCR检测基因表达

以反转录得到的cDNA为模板，使用实时荧光定量PCR试剂盒，分别检测CDH1基因以及相关miRNAs的表达水平。以GAPDH作为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

**双荧光素酶报告基因实验验证miRNA与CDH1的靶向关系

构建含有CDH13UTR野生型和突变型（突变miRNA结合位点）的双荧光素酶报告基因载体。将miRNA模拟物或阴性对照与报告基因载体共转染至细胞中，转染后[设定时间]，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。若miRNA与CDH13UTR存在靶向结合关系，则miRNA模拟物转染组的荧光素酶活性会显著降低。

**Westernblot检测蛋白质表达

转染后[设定时间]，收集细胞，使用蛋白质提取试剂盒提取细胞总蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度。取适量的蛋白样品进行SDS电泳，将分离后的蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭后，依次加入抗E-cadherin抗体和内参抗体（如β-actin抗体），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤膜后，加入相应的二抗，室温孵育1-2小时，再次洗涤后，使用化学发光试剂进行显影，检测E-cadherin蛋白的表达水平。

四、实验结果与分析

（一）CDH13UTR区上miRNA结合位点的预测结果

通过生物信息学软件分