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抗全蚀转SN1及PvPGIP2基因小麦的功能鉴定

摘要

本研究旨在对转SN1及PvPGIP2基因小麦的功能进行鉴定。通过一系列实验，包括体外抑菌、分子检测、基因表达分析以及抗病性鉴定等，深入探究了这两个基因在小麦抗全蚀病中的作用。结果表明，SN1基因和PvPGIP2基因在转基因小麦中均能稳定遗传和表达，并且显著提高了小麦对全蚀病的抗性，为小麦抗全蚀病育种提供了重要的理论依据和基因资源。

关键词

小麦；全蚀病；SN1基因；PvPGIP2基因；功能鉴定

一、引言

小麦全蚀病（Gaeumannomycesgraminisvar.tritici）是一种严重危害小麦生产的根部病害，可导致小麦减产甚至绝收。传统的防治方法如化学防治和农业防治，存在环境污染和效果不稳定等问题。因此，利用基因工程技术培育抗全蚀病小麦品种具有重要意义。

SN1基因是一种具有抗菌活性的基因，其编码的蛋白可能在植物防御反应中发挥作用。PvPGIP2基因编码的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）能够抑制病原真菌细胞壁降解酶的活性，从而增强植物的抗病性。本研究将这两个基因导入小麦，对其功能进行鉴定，为抗全蚀病小麦的培育提供新的途径。

二、材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

受体小麦品种为扬麦18，转SN1基因小麦和转PvPGIP2基因小麦由本实验室通过基因枪转化法获得。

2.1.2菌株和载体

小麦全蚀病菌（Gaeumannomycesgraminisvar.tritici）由本实验室保存。pAHC25载体用于构建基因表达载体。

2.1.3试剂和仪器

限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶等购自TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；其他试剂均为国产分析纯。PCR仪、凝胶成像系统、荧光定量PCR仪等仪器购自Bio-Rad公司。

2.2实验方法

2.2.1SN1的体外抑菌实验

采用琼脂扩散法，将含有SN1蛋白的粗提液加入到含有小麦全蚀病菌的琼脂平板上，观察抑菌圈的大小，以确定SN1的体外抑菌活性。

2.2.2转基因小麦的分子检测

采用PCR技术，对转SN1基因小麦和转PvPGIP2基因小麦的T0-T4代植株进行外源基因的检测。引物根据SN1基因和PvPGIP2基因的序列设计，以确定外源基因是否整合到小麦基因组中。

2.2.3转SN1基因小麦的Southernblot分析

提取转SN1基因小麦的基因组DNA，用限制性内切酶酶切后进行Southernblot分析，以确定SN1基因在小麦基因组中的拷贝数和整合位点。

2.2.4转SN1基因小麦的Westernblot分析

提取转SN1基因小麦的总蛋白，进行SDS-PAGE电泳后转膜，用抗SN1蛋白的抗体进行Westernblot分析，以检测SN1蛋白在转基因小麦中的表达情况。

2.2.5转基因植株中SN1基因的表达分析与全蚀病抗性分析

采用荧光定量PCR技术，分析转SN1基因小麦中SN1基因在不同生长时期和不同组织中的表达水平。同时，对转基因小麦进行全蚀病接种实验，观察发病情况，统计病情指数，分析SN1基因表达与全蚀病抗性的关系。

2.2.6PvPGIP2基因表达载体的构建及小麦转化

根据PvPGIP2基因的序列，设计引物并扩增目的基因片段，将其克隆到pAHC25载体中，构建pAHC25-PvPGIP2表达载体。采用基因枪转化法将表达载体导入小麦扬麦18的幼胚愈伤组织，经过筛选和再生获得转基因植株。

2.2.7转PvPGIP2基因小麦的分子检测

同2.2.2，对转PvPGIP2基因小麦的T0-T4代植株进行PCR检测，确定外源基因的整合情况。

2.2.8转基因植株中PvPGIP2基因的表达分析与全蚀病抗性分析

采用荧光定量PCR技术分析转PvPGIP2基因小麦中PvPGIP2基因的表达水平。进行全蚀病接种实验，统计病情指数，分析PvPGIP2基因表达与全蚀病抗性的关系。

三、结果与分析

3.1SN1的体外抑菌结果

含有SN1蛋白粗提液的琼脂平板上出现了明显的抑菌圈，抑菌圈直径为[X]mm，表明SN1具有较强的体外抑菌活性，能够抑制小麦全蚀病菌的生长。

3.2转基因小麦的分子检测结果

3.2.1转SN1基因小麦

在转SN1基因小麦的T0-T4代植株中，均能扩增出与目的基因大小一致的条带，而非转基因小麦中未出现该条带，说明SN1基因已成功整合到小麦基因组中，并能够稳定遗传。