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基于OWLS技术剖析靶序列二级结构对固液界面DNA杂交动力学的影响

一、引言

1.1研究背景与意义

基因芯片技术自上世纪80年代初诞生以来，凭借其高通量、速度快、成本低等显著优点，在众多领域取得了长足发展。特别是在基因表达谱分析、测序、基因突变检测、SNP检测以及临床疾病诊断等方面，已得到广泛应用。例如，在癌症诊断中，基因芯片能够快速检测出与癌症相关的基因表达变化，为医生提供重要的诊断依据。然而，现阶段基因芯片技术存在一个瓶颈问题，即基因芯片杂交结果重复性较差，这严重限制了其进一步发展和临床应用。当靶序列长于探针序列时，靶序列及其与探针杂交后的游离端在溶液中会形成立体结构，这种立体结构的靶序列分子的热力学扩散运动，不仅影响杂交体的形成，还会使杂交体的解离常数增加，甚至导致杂交体不能稳定存在。因此，靶序列分子结构被认为是影响杂交动力学的重要因素。

光波导模式光谱（OpticalWaveguideLightmodeSpectroscopy，OWLS）技术作为一种在集成光学领域相对较新的技术，能够提供一个温度可调（T变化小于0.1℃）的恒温外循环杂交体系平台。其外接的微流体控制系统可以不断地将预先注入样品池的样品补充到杂交反应池内，从而维持杂交反应池内在杂交过程中靶序列浓度相对恒定。此外，OWLS是非标记的检测方法，通过实时检测杂交信号NTE和NTM的变化，应用OWLS自身转换软件将NTE或NTM换算成Mass、dM/dT（M）等与动力学相关的数据结果，并通过屏幕多个窗口一同显示，使得研究人员能够实时监测杂交动力学的动态过程。

本课题旨在研究不同类型靶核酸二级结构和靶核酸热力学扩散对固/液界面核酸杂交动力学过程的影响。通过深入探究不同靶序列的二级结构在一定条件下对与已知序列探针杂交动力学的影响规律，能够为基因芯片探针设计提供坚实的实验基础和理论依据，有望解决基因芯片杂交结果重复性差的问题，推动基因芯片技术在临床诊断等领域的更广泛应用。

1.2国内外研究现状

在靶序列结构与DNA杂交动力学关系的研究方面，国内外学者已取得了一定成果。国外研究发现，靶序列的长度、碱基组成以及二级结构等因素都会对杂交动力学产生显著影响。当靶序列存在复杂的二级结构时，如发夹结构、茎环结构等，会阻碍其与探针的杂交，降低杂交效率。国内相关研究也表明，靶序列的空间构象变化会改变杂交反应的速率和解离常数。然而，目前对于不同类型靶核酸二级结构对杂交动力学影响的系统研究还相对较少，尤其是在固液界面这种复杂环境下的研究还存在诸多空白。

在OWLS技术应用方面，国外已将其广泛应用于生物大分子相互作用、磷脂双分子层行为等研究领域。利用OWLS技术研究蛋白质与DNA的相互作用，能够实时监测分子结合和解离的动态过程，获取准确的动力学参数。国内也逐渐开始关注OWLS技术，并在一些生物传感器的研发中有所应用。但在利用OWLS技术研究靶序列二级结构对DNA杂交动力学影响方面，国内外的研究都还处于起步阶段，相关的研究报道较少。现有研究主要集中在利用OWLS技术对简单的核酸杂交体系进行监测，对于复杂的靶序列结构和多样化的杂交条件的研究还不够深入。

1.3研究内容与方法

本研究主要内容包括：利用OWLS技术研究不同类型靶核酸二级结构，如发夹结构、茎环结构、假结结构等对固液界面DNA杂交动力学的影响；探究靶核酸热力学扩散对杂交动力学的作用机制，分析热力学扩散系数与杂交速率、解离常数等动力学参数之间的关系。

研究方法上，采用实验研究与数据分析相结合的方式。在实验方面，构建不同类型靶核酸的实验体系，利用OWLS技术实时监测杂交过程中信号的变化，获取动力学数据；通过改变实验条件，如温度、离子强度、靶序列浓度等，研究这些因素对杂交动力学的影响。在数据分析方面，运用统计学方法对实验数据进行处理和分析，建立动力学模型，深入探讨靶序列二级结构和热力学扩散对杂交动力学的影响规律。

二、OWLS技术原理与应用

2.1OWLS技术概述

光波导模式光谱（OpticalWaveguideLightmodeSpectroscopy，OWLS）技术在集成光学领域中是一个相对较新的产物。作为一项研究发生在固体与液体界面过程的技术，它将检测灵敏度、获得的信息量以及系统易用性提升到了一个更高的水平，甚至超越了一些影响深远的技术，如椭圆偏光法和表面等离子体共振（SPR）。椭圆偏光法可用于透明或不透明的基底，SPR则必须与贵金属基底配合使用。而在生物学应用方面，OWLS不仅具有较高的固有灵敏度，其便利性和通用性也优于其他常见的非标记检测方法。该技术通过检测波导附近的有效折射率变化进行传感，同时对TM/