纳豆激酶基因克隆与在大肠杆菌和乳酸乳球菌中表达的深度剖析.docxVIP

纳豆激酶基因克隆与在大肠杆菌和乳酸乳球菌中表达的深度剖析

一、引言

1.1研究背景与意义

纳豆激酶（Nattokinase，简称NK）是一种由枯草芽孢杆菌分泌的丝氨酸蛋白酶，在纳豆发酵过程中产生，是一种具有特殊功能的活性物质。其分子量为27.7kDa，由275个氨基酸残基组成，呈单链多肽酶结构。这种激酶具有底物专一性，拥有特定的蛋白水解位点与结合位点。在理化性质上，纳豆激酶为白色或淡黄色固体，无臭味且可溶于水，等电点为8.6±0.3，在pH为7-12的环境中较为稳定，其中pH在7-9时酶活性最为稳定，不过在pH5的酸性条件下虽不稳定但酶活性不会完全丧失，在胃中会被部分降解，但在小肠中能保持稳定。其溶液在45℃以下活性相对稳定，当温度高于60℃时活性逐渐丧失，反复冻融5次后，仍有95%的酶能保持活性。

在生理作用方面，纳豆激酶具有突出的溶栓作用，不仅能够溶解已形成的血栓，还能预防血栓形成，是一种高效且安全的溶栓活性纤溶酶，与传统溶栓药物相比，具有溶栓效果好、药效时间长、安全无毒副作用、成本低、可口服且不易造成出血等优势，具有多元化的溶栓机制，不仅可以刺激血管内皮细胞将尿激酶激活，进而将纤溶酶原激活为纤溶酶去溶解纤维蛋白，还能直接水解纤维蛋白，改善血液的黏度和增强血管的弹性。它还具备降血压功效，通过降解血浆中的纤维蛋白以及阻止血浆血管紧张素Ⅱ水平的升高来预防和治疗高血压。在调节肠道方面，作为由纳豆杆菌产生的蛋白酶，纳豆激酶可以促进有益厌氧菌生长，抑制有害需氧菌生长，且受肠道环境影响较小，能较好地发挥作用。此外，纳豆激酶在辅助治疗其他心脑血管疾病、抗动脉粥样硬化、降血脂、保护神经细胞预防阿尔兹海默症、治疗慢性鼻窦炎等方面也有积极作用。

基于纳豆激酶这些优异的特性，其在医药和食品等领域展现出广阔的应用前景。在医药领域，可作为新一代血栓药物开发，用于预防和治疗心脑血管疾病，如冠心病、心肌梗死、中风等血栓相关病症，以补充或替代现有溶栓药物，降低药物副作用风险，提高患者治疗效果与生活质量。在食品领域，因其具有调节肠道、抗衰老、改善血液循环等功效，可作为功能性成分添加到食品中，制成具有保健功能的食品或膳食补充剂，满足消费者对健康食品的需求，如添加到酸奶、饮料、糕点等日常食品中，为人们提供便捷的健康保障方式。

然而，天然提取的纳豆激酶存在产量低、成本高的问题，难以满足日益增长的市场需求。基因克隆技术能够获取大量目标基因，为后续的基因操作和表达研究提供物质基础。通过将纳豆激酶基因克隆到合适的表达系统中，如大肠杆菌和乳酸乳球菌，可以实现纳豆激酶的大量生产，提高其产量并降低成本。大肠杆菌是常用的原核表达系统，具有遗传背景清楚、生长迅速、易于培养和操作等优点；乳酸乳球菌作为一种重要的乳酸菌，是食品级安全微生物，在食品发酵工业中广泛应用，将纳豆激酶基因在乳酸乳球菌中表达，不仅可实现高效生产，还能直接应用于食品领域，开发具有溶栓功能的食品，具有重要的实际应用价值。对纳豆激酶基因克隆及其在大肠杆菌和乳酸乳球菌中的表达进行研究，能够深入了解纳豆激酶的分子生物学特性和表达调控机制，为其大规模生产和广泛应用提供坚实的理论基础和技术支持，对于推动医药和食品等相关产业的发展具有重要意义。

1.2国内外研究现状

自1980年日本学者须见洋行发现纳豆激酶以来，国内外对其研究不断深入。在基因克隆方面，1992年Nakamura利用鸟枪法在大肠杆菌中成功克隆得到纳豆激酶基因，并测定了其核苷酸序列，此后，科研人员不断优化克隆方法。国内学者也积极开展相关研究，通过改进PCR扩增条件等方式，提高纳豆激酶基因克隆的效率和准确性。

在大肠杆菌表达纳豆激酶的研究中，众多学者致力于构建高效表达载体和优化表达条件。研究表明，将纳豆激酶基因插入到pET-32a等质粒中，能够产生高效的纳豆激酶表达，其活性与纯化的纳豆激酶相当。通过优化诱导剂浓度、诱导时间、培养温度等条件，进一步提高了纳豆激酶在大肠杆菌中的表达量和活性。然而，大肠杆菌表达系统也存在一些问题，如表达的蛋白可能形成包涵体，需要复杂的复性过程，且大肠杆菌本身并非食品级微生物，其表达产物在食品领域应用存在一定限制。

在乳酸乳球菌表达纳豆激酶的研究上，国外研究人员采用基于pNZ8148的质粒系统将纳豆激酶基因插入到乳酸乳球菌中，使其稳定表达纳豆激酶，经过4小时的发酵后，乳酸乳球菌中的纳豆激酶活性可达到42.5U/mg，与纯化的纳豆激酶活性相当。国内研究也在探索不同的表达载体和调控元件，以提高纳豆激酶在乳酸乳球菌中的表达水平。但目前乳酸乳球菌表达纳豆激酶的产量和稳定性仍有待进一步提高，表达调控机制的研究还不够深入。

总体而言，当前纳豆激酶基因克隆和表达的