徐淮山羊Sox2、c-Myc和Oct4基因启动子功能的初步研究.docxVIP

徐淮山羊Sox2、c-Myc和Oct4基因启动子功能的初步研究

一、研究背景

徐淮山羊是我国优良的地方山羊品种，具有生长速度快、肉质鲜美、适应性强等特点，在畜牧业生产中占据重要地位。基因的表达调控是生命活动的核心过程之一，而启动子作为基因表达调控的关键区域，在转录起始过程中发挥着至关重要的作用。

Sox2、c-Myc和Oct4基因均为重要的转录因子，在细胞的增殖、分化、胚胎发育等过程中具有广泛而关键的调控作用。Sox2基因参与维持干细胞的多能性和自我更新能力，在胚胎发育的早期阶段起着重要的调控作用；c-Myc基因与细胞的增殖、凋亡以及肿瘤发生等密切相关，能够促进细胞的生长和分裂；Oct4基因是胚胎干细胞多能性的主要调控因子，对于维持干细胞的未分化状态至关重要。

深入研究徐淮山羊Sox2、c-Myc和Oct4基因启动子的功能，有助于揭示这三个基因在徐淮山羊生长发育、细胞分化等过程中的表达调控机制，为徐淮山羊的遗传改良、品种培育以及相关疾病的研究提供理论依据。目前，关于这三个基因启动子在徐淮山羊中的功能研究尚处于初步阶段，因此开展本研究具有重要的理论和实践意义。

二、材料与方法

（一）实验材料

样本来源：选取健康的徐淮山羊胎儿组织（如肝脏、肾脏、肌肉等），用于基因启动子的克隆和相关实验。样本采集后迅速置于液氮中冷冻保存，随后转移至-80℃超低温冰箱中保存备用。

主要试剂：TaqDNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、荧光素酶报告基因检测试剂盒等，均购自知名生物试剂公司，且均在有效期内使用。

主要仪器：PCR仪、凝胶成像系统、荧光分光光度计、离心机等。

（二）实验方法

基因启动子的克隆

（1）根据GenBank中已公布的山羊Sox2、c-Myc和Oct4基因的序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，引物两端分别引入合适的限制性内切酶位点。

（2）提取徐淮山羊胎儿组织的基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为：模板DNA1μL，上、下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，dNTPs2μL，10×PCR缓冲液5μL，ddH?O40.5μL，总反应体积50μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，退火温度（根据不同引物设定）30s，72℃延伸（根据扩增片段长度设定），共35个循环；72℃终延伸10min。

（3）PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用胶回收试剂盒回收目的片段。将回收的目的片段与pMD19-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。挑取单菌落进行PCR鉴定和测序分析，筛选出阳性克隆。

启动子缺失载体的构建

（1）根据已克隆的启动子序列，设计一系列不同长度的缺失片段引物，同样引入相应的限制性内切酶位点。

（2）以阳性克隆质粒为模板，利用PCR技术扩增不同长度的启动子缺失片段。

（3）将扩增得到的缺失片段和pGL3-Basic载体分别用相应的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经胶回收后，用DNA连接酶连接，构建启动子缺失荧光素酶报告基因载体。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆并进行测序验证。

细胞转染与荧光素酶活性检测

（1）将培养至对数生长期的293T细胞接种于24孔板中，待细胞密度达到70%-80%时进行转染。

（2）按照Lipofectamine3000转染试剂说明书的操作步骤，将构建好的启动子缺失载体与内参质粒pRL-TK（海肾荧光素酶报告基因质粒）共转染至293T细胞中。每个处理组设置3个重复孔。

（3）转染48h后，收集细胞，按照荧光素酶报告基因检测试剂盒的说明进行操作，利用荧光分光光度计检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值作为启动子的相对活性。

生物信息学分析

利用在线生物信息学软件（如TFSEARCH、JASPAR等）对克隆得到的Sox2、c-Myc和Oct4基因启动子序列进行转录因子结合位点预测，分析可能参与启动子调控的转录因子。

三、结果与分析

（一）基因启动子的克隆结果

经PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳显示，在预期位置出现了特异性条带，大小与设计的Sox2、c-Myc和Oct4基因启动子片段相符。测序结果表明，克隆得到的启动子序列与GenBank中公布的山羊相应基因序列同源性较高，说明成功克隆了徐淮山羊Sox2、c-Myc和Oct4基因的启动子片段。

（二）启动子缺失载体的构建结果

通过